《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Cold-adapted RNA polymerase from Pseudomonas phage Njord improves synthesis of therapeutic mRNA
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噬菌体T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）推动了mRNA疫苗的发展，并在该治疗模式的制造中占据核心地位。研究人员报道了T7 RNAP的一个天然同源酶——Njord RNA聚合酶（Njord RNAP），其可在显著更低的温度下实现高产RNA合成。Njord RN
噬菌体T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）推动了mRNA疫苗的发展，并在该治疗模式的制造中占据核心地位。研究人员报道了T7 RNAP的一个天然同源酶——Njord RNA聚合酶（Njord RNAP），其可在显著更低的温度下实现高产RNA合成。Njord RNAP生成的mRNA中炎症型RNA污染物水平明显降低，对转录反应的比较分析揭示了这些杂质物种的起源。上述特性使Njord RNAP成为低温RNA合成的有价值工具，也是提升mRNA治疗药物性能与可放大性的有力候选。源自假单胞菌噬菌体Njord基因组的RNA聚合酶为合成mRNA及其他治疗性核酸提供了新工具。该酶来源于海洋微生物生态系统，即使在低温条件下也能高产转录RNA。研究人员阐述了该酶与mRNA合成相关的关键属性，包括转录保真度、启动子特异性、修饰核苷酸掺入以及RNA杂质谱，并重点考察了污染性双链RNA（dsRNA）的形成。转录反应分析表明，DNA模板依赖的启动子非依赖性转录是可检测dsRNA杂质的主要来源，而Njord RNAP该活性极低。鉴于dsRNA在合成mRNA中的已知炎症作用，细胞培养转录组分析与活体动物研究均显示，Njord RNAP合成的mRNA仅引发极小免疫响应。该天然酶可在常温高效合成mRNA，且转录本基本无dsRNA，有望简化mRNA制造流程。
研究背景方面，mRNA疫苗在SARS-CoV-2大流行中的成功推动了该治疗模式的发展， canonical mRNA、自扩增RNA（saRNA）与环状RNA设计结合序列工程、5′与3′端工程化及修饰核苷酸，以延长蛋白表达、逃逸先天免疫并提升疗效。噬菌体T7 RNAP是上述分子合成与制造的通用酶，已有定向进化、计算设计及筛选Autographivirales同源酶等改造尝试。关键质量指标为双链RNA（dsRNA）污染物：dsRNA可被TLR-3、MDA5、RIG-I等模式识别受体（PRR）识别，激活PKR与2′–5′寡腺苷酸合成酶（OAS）引发促炎与翻译抑制；即便用N1-甲基假尿苷（m1Ψ）等修饰核苷酸，修饰后dsRNA仍具炎症性。现有去除dsRNA依赖色谱纯化，若在合成端消除将降本提质。T7 RNAP产生dsRNA的机制存疑，包括RNA折返引发RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）延伸、及启动子非依赖性于非模板链3′端起始合成反义RNA两种假说。
研究人员自海洋源Colwellvirinae亚科假单胞菌噬菌体Njord中鉴定其RNAP，系统比较Njord与T7 RNAP的生物化学活性、mRNA杂质谱及在A549细胞与BALB/c小鼠中的免疫响应，指出启动子非依赖性转录是免疫刺激性dsRNA的主要来源。论文发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》。
主要关键技术方法概括（不超250字）：研究人员从假单胞菌噬菌体Njord基因组预测启动子并构建位置权重矩阵，以线性化质粒为模板在4–48℃区间比较产率；用单分子深度测序评估保真度；以荧光标记RNA寡核苷酸与含末端四鸟苷DNA模板分别检测折返引发与启动子非依赖性转录；以毛细管电泳、native PAGE、RNase III/If消化、吖啶橙染色、J2抗体dot-blot、均相时间分辨荧光（HTRF）及UPLC–MS/MS定量5′三磷酸寡核糖核苷酸；在A549与RIG-I敲除A549细胞中做转录组与IFN-β分泌检测；以BALB/c小鼠经脂质纳米颗粒（LNP）尾静脉注射Fluc mRNA，活体成像与血清IFN-α量化。样本含实验室构建Fluc、EGFP、EPO及9.7 kb saRNA模板。
研究结果部分保留小标题叙述如下。
Characterization of Njord RNAP for IVT：系统发育定位Njord属Colwellvirinae，其RNAP最适温比T7低10–15℃，12℃时T7近失活而Njord产RNA>1 mg/mL；筛得优化启动子p4（T-17G、+2G→A）；可掺入m1Ψ、Ψ、mo5U、m5C且凝胶迁移与T7产物一致；25℃保真度略低（67±8×10?6误/base，A|G颠换偏高），但<1/10?不影响实用；共转录加帽中三核苷酸Cap AG/AU掺入差，二核苷酸抗反向帽类似物可得>90%加帽，初始转录序列（ITS）GAA时5′均一性最佳。
dsRNA Production by Njord RNAP：模型底物显示两者折返引发延伸相当且随温升Njord活性降；含末端四鸟苷DNA模板上T7产RNase III敏感、RNase If抵抗、吖啶橙阳性dsRNA条带，Njord极微量；UPLC–MS/MS未检出折返引发的反义延伸，但检出BspQI切位点旁启动子非依赖性5′三磷酸反义寡核糖核苷酸，T7产量更高；J2免疫印迹与HTRF（>200 bp定量准）显示Njord在各mRNA（Fluc/EGFP/EPO）、修饰与否下dsRNA约为T7的1/100，结论指向DNA模板依赖启动子非独立性转录为主源而非折返。
Immunostimulatory Properties of Synthetic mRNA：A549中转染Njord合成未修饰或m1Ψ修饰Fluc mRNA，转录组病毒防御相关基因上调极少，IFN-β不可检；T7显著上调且m1Ψ部分缓解；RIG-I敲除取消响应。小鼠LNP递送Fluc mRNA时萤光素酶表达不受聚合酶影响，T7+m1Ψ提升表达；高剂量下血清IFN-α受聚合酶与修饰双重影响，Njord 25℃+m1Ψ近无刺激。
讨论部分总结：比较两酶dsRNA通路可见均具折返延伸能力，差异在启动子非依赖性转录强弱，故Njord转录本dsRNA降数个数量级并伴细胞与小鼠细胞因子响应降低，支持DNA依赖启动子非独立性转录为激活TLR-3/MDA5/RIG-I的杂质源；m1Ψ仅部分缓解dsRNA识别，Njord+m1Ψ近免疫沉默，ssRNA经TLR7/8感知亦被m1Ψ削弱。m1Ψ提升T7 mRNA表达不只因遮掩dsRNA（OAS/PKR），Loop-back 3′延伸或TRIM25介导ssRNA降解仍使m1Ψ有益。Njord源海洋低温环境，>30℃失活，冷适应或为稳定性—柔性权衡；Colwellvirinae与Molineuxvirinae间最适温无显式序列决定子。Njord允许常温/低温IVT保长核酸完整，除本研究外尚未系统优化，可作拆解mRNA免疫原性工具。
结论翻译：假单胞菌噬菌体Njord及相关Colwellvirinae病毒源于海洋环境，Njord RNAP在25℃及以下高效合成RNA，>30℃完全失活，表明Autographivirales RNAP转录效率适应环境温。冷适应酶通常理解为热力学稳定性与柔性催效的权衡，但该观点有争议。T7 RNAP在制造中速率受起始或延伸限制依条件而定，Colwellvirinae RNAP可能调节起始/延伸动力学，与暖适应Molineuxvirinae比较未显最适温序列决定子，本研究为理解该类酶热适应奠基。Njord RNAP除本研究外几未开发，其常温/低温IVT可护长核酸完整，有望助研究界拆解mRNA疗法免疫反应并改进此类核酸药合成。
