快速进化的蚜虫虫瘿效应蛋白呈现皂苷样折叠

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Rapidly evolving aphid gall effector proteins exhibit saposin-like folds

　　

许多昆虫通过注射效应蛋白来操纵植物。在一个分子“劫持”的极端例子中，Hormaphis cornu蚜虫将bicycle蛋白注入Hamamelis virginiana，促进称为虫瘿的新型器官发育。Bicycle蛋白与已知功能的蛋白没有任何氨基酸序列相似性。在此，研究人员报道了两个不同bicycle蛋白的晶体结构。这两个蛋白都含有皂苷样折叠：其中一个具有多个二硫键并表现出结构域交换拓扑；另一个没有二硫键，并拥有两个不同的串联结构域。为了探索bicycle蛋白的结构进化，研究人员尝试使用Alphafold2（AF2）和其他深度学习程序预测bicycle蛋白结构。虽然AF2使用现有数据库未能恢复这两个实验结构，但当提供来自新测序的近缘物种的蛋白序列多序列比对（MSA）时，它成功了。利用这种方法，研究人员从七个蚜虫物种中生成了2，400个高置信度的bicycle蛋白结构预测。虽然所有蚜虫bicycle蛋白都含有预测的皂苷样折叠，但它们在结构和理化性质上表现出巨大的多样性。虽然这种多样性阻碍了结构编码的保守功能的预测，但它表明bicycle蛋白已进化为靶向多种植物过程并/或逃避植物免疫监视。研究人员将AF2与来自近缘物种蛋白的定制MSA相结合，为预测快速进化蛋白家族的结构提供了一种通用的、强大的方法。

**快速进化的蚜虫虫瘿效应蛋白：结构、预测与功能多样性的整合解读**

**一、研究背景与科学问题**

在宿主-寄生生物互作中，病原物和寄生生物通过向宿主细胞注入效应蛋白来操纵宿主的生理、发育乃至行为。宿主则相应进化出免疫系统以识别和抑制这些效应蛋白。二者之间的持续拮抗常驱动效应蛋白的快速分子进化，形成所谓的分子“军备竞赛”。由此产生的效应蛋白往往与已知功能蛋白缺乏显著的氨基酸序列相似性，使得传统基于序列同源性的功能预测难以奏效，成为结构生物学和功能基因组学的一大挑战。

蚜虫作为韧皮部取食昆虫，通过向植物细胞分泌唾液蛋白以获取营养并抑制植物防御。其中最为极端的植物操纵现象之一是诱导形成虫瘿，即植物细胞生长发育被重新编程而产生的新型器官。虫瘿为蚜虫提供封闭、营养丰富的庇护所，使其免受捕食者、寄生者和不利环境的影响。在Hormaphis cornu中，bicycle蛋白家族已被鉴定为影响虫瘿发育的蚜虫效应蛋白。该家族成员“虫瘿颜色决定因子”可特异性调控花青素生物合成途径中单个基因的表达，使红色虫瘿转变为绿色，展现出强效而精确的植物操纵能力。然而，单个bicycle蛋白如何在分子水平实现如此特异而强大的功能，尚不明确。由于强多样化选择，bicycle基因家族快速进化，H. cornu基因组编码超过650个bicycle旁系同源基因，且所有已检视的蚜虫基因组均编码bicycle基因，暗示该家族在蚜虫中广泛参与植物操纵。绝大多数bicycle蛋白具有N端分泌信号序列和一对间隔分布的半胱氨酸-酪氨酸-半胱氨酸（C-Y-C）基序（bicycle家族因此得名，意为“bi-CYC-like”）。然而除信号序列外，这些蛋白与已知蛋白或功能域无任何相似性，其分子结构完全未知。因此，解析bicycle蛋白结构是理解其功能与进化的关键。

**二、主要发现与结论概述**

研究人员通过X射线晶体学解析了两个极端分化的H. cornu bicycle蛋白g3873和g2703的高分辨率结构。两结构均含有皂苷样折叠（saposin-like fold），但拓扑结构截然不同：g3873为结构域交换的皂苷样折叠，g2703为串联皂苷样折叠。鉴于这两个结构均与已知蛋白结构不相似，且默认深度学习程序无法从公共数据库生成有效预测，研究人员测序了三个近缘物种的基因组，并结合已有基因组构建定制多序列比对（MSA），成功使AlphaFold2（AF2）准确预测了这两个实验结构。在此基础上，研究人员利用此方法预测并筛选出跨越七个蚜虫物种的2，400个高置信度bicycle蛋白结构。该数据集显示bicycle蛋白在结构上形成多个离散簇，但在理化性质上近乎均匀分布，提示其功能高度多样化。该研究发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

**三、主要关键技术方法**

该研究综合运用了多种结构生物学与计算生物学方法。通过X射线晶体学分别以硫-单波长反常衍射（sulfur-SAD）定相和硒代甲硫氨酸多波长反常衍射（MAD）定相解析了两个bicycle蛋白结构。为生成可用的同源序列信息，研究人员对H. betulae、H. hamamelidis和Hamamelistes spinosus三种近缘物种进行基因组测序（10× Genomics Chromium链读文库），并利用RNA-seq验证基因表达。AF2结构预测在定制MSA辅助下实现。研究还利用t-SNE/UMAP降维、TM-score结构比对、Levenshtein距离和ABEGO骨架编码等方法系统分析蛋白质序列-结构-理化空间。样本来源为多种蚜虫物种的唾液腺转录组和基因组。

**四、研究结果**

**A Bicycle Protein with Helix Swapped Saposin-Like Folds（具有螺旋交换皂苷样折叠的Bicycle蛋白）**

研究人员基于已有转录组选出18个在H. cornu唾液腺高表达的bicycle基因进行异源表达，其中7个成功表达纯化，g3873和g2703获得衍射级晶体。g3873结构以2.0 ?分辨率通过硫-SAD定相解析，呈现全螺旋折叠，由两个四螺旋束亚结构域组成。结构域交换由两个涉及CYC基序保守半胱氨酸的二硫键维持，另有第三个二硫键稳定局部构象。虽然每簇四个α螺旋均类似皂苷折叠，但g3873整体结构与蛋白质数据库（PDB）中所有已知结构不相似，且缺乏经典皂苷的疏水内部表面，提示其不应具有脂质结合功能。

**A Bicycle Protein with Tandem Saposin-Like Folds（具有串联皂苷样折叠的Bicycle蛋白）**

g2703与bicycle家族序列分歧极大，完全不含半胱氨酸，但依据内含子-外显子结构分类器仍鉴定为bicycle基因家族成员。其1.4 ?分辨率结构包含两个串联皂苷样结构域，由一条长的中心螺旋连接。该中心螺旋似乎由第一个皂苷样单元的最后一条螺旋与第二个单元的起始螺旋融合而成。与g3873相似，两个皂苷样折叠均缺乏强两亲性特征。g3873和g2703虽序列无相似性，却都采用皂苷样折叠，支持二者起源于含有saposin样结构域的祖先蛋白，也表明基于基因结构的分类器能识别无法通过序列相似性鉴定的bicycle同源物。

**AlphaFold2 Can Predict Bicycle Protein Structures Using Custom MSA（AlphaFold2可利用定制MSA预测Bicycle蛋白结构）**

两个bicycle蛋白结构作为CASP15挑战赛目标提交（T1130和T1131）。虽然多数团队预测g3873获得较高GDT_TS评分，但g2703是整个CASP15中得分最低的目标，平均GDT_TS仅12分。关键区别在于g3873预测所用的MSA来自此前公开的bicycle蛋白，而g2703的近缘同源物未包含在任何已有基因组中。研究者测序了H. betulae、H. hamamelidis和H. spinosus基因组，并重新注释了S. chinensis、T. akinire及A. pisum的基因组，共获得7个物种的bicycle基因集合。据此构建定制MSA后，AF2成功准确预测了g3873和g2703的实验结构。利用此方法，AF2生成了4，924个bicycle蛋白结构预测，经严格过滤后得到2，400个高置信度模型。MSA深度分析表明，至少16个同源物的MSA即可达到接近全MSA的预测精度，说明对近缘物种的基因组测序可为快速进化蛋白家族的结构预测提供有效策略。

**Bicycle Proteins Exhibit Extensive Structural Diversity and Surface Variability（Bicycle蛋白呈现广泛的结构多样性与表面变异性）**

所有高置信度预测结构均含有至少一个皂苷样结构域，但该结构域的形态、大小和排列差异极大。几乎所有bicycle蛋白均为螺旋交换型，而g2703的直系同源中共鉴定出四个推定的串联型旁系同源。研究者提出串联型bicycle蛋白可能由一个螺旋交换的祖先通过结构域重组及随后的半胱氨酸丢失演化而来。在整个家族层面，氨基酸序列距离显示出极端分歧，几乎无序列簇形成。相比之下，基于ABEGO骨架态编码的距离显示bicycle蛋白保留了中等程度的骨架结构相似性。t-SNE嵌入的全对全TM-score比对揭示17个结构聚类和6种不同的皂苷样结构域排列模式，包括1到6个结构域的不同组合。不同聚类中存在显著的物种特有分布，但近缘的Hormaphis和Hamamelistes物种几乎占据所有聚类，表明同一物种内也编码广泛的蛋白结构多样性。

**Bicycle Proteins Occupy Diverse Physicochemical Spaces（Bicycle蛋白占据多样化理化空间）**

研究者计算了所有预测结构的22项理化特征，选取不相关特征进行UMAP嵌入。Bicycle蛋白在理化空间中呈现近乎连续的分布，而非离散聚类。仅有的少数可解释亚群由表面疏水性、电荷平衡和两亲性的不同定量组合分化而来：一个亚群以疏水性和斑块形态为特征，一个亚群主要由静电荷控制（正电、负电或强表面偶极），一个亚群则以高疏水矩的两亲性螺旋为特征。这些理化亚群没有物种区隔，说明理化可变性横跨整个bicycle蛋白家族。

**Lack of Conserved Domains Thwarts the Prediction of Bicycle Protein Functions（保守结构域缺乏阻碍Bicycle蛋白功能预测）**

序列熵分析显示bicycle蛋白的所有保守残基均埋藏于蛋白内部，极可能用于维持结构堆积，而所有表面残基均高度可变。对预测模型的二硫键连接模式分类显示，三种主导连接模式合计仅约占数据集的28%，且与经典的臭鱼结合蛋白（OBP）的二硫键拓扑完全不同，排除了OBP家族归属。MSA水平的挫折分析（FrustraEvo）表明，保守的能量支架仅由二硫键和一小簇疏水或芳香核心组成，其余位置能量中性；且最大挫折残基在埋藏层中比溶剂暴露层富集约三倍，与真菌孤儿候选效应子中表面挫折重排模式相反。表面上缺乏任何特定保守序列标签，使得无法从当前数据推测bicycle蛋白的分子功能。

**五、讨论与结论**

病原体常向宿主注入效应蛋白以塑造宿主环境，但大多数效应蛋白缺乏已知功能结构域，功能破译困难。该研究通过X射线晶体学证实bicycle蛋白与经典皂苷的功能并不相同——经典皂苷具有可暴露的疏水核心以捕获脂质，而bicycle蛋白的两个结构均缺乏此特性。皂苷样折叠可能为快速进化的溶剂暴露表面提供了一个刚性的骨架平台，多种独立蛋白家族中该折叠的反复出现可能反映了趋同进化。AF2在提供定制MSA后取得的成功强调了一种通用策略：通过对多个近缘物种的基因组聚焦测序为快速进化的蛋白家族构建信息丰富的MSA，从而突破默认数据库的同源搜索限制。bicycle蛋白在序列和结构上高度分化，物理化学性质上近乎连续，这些多样性与其表面残基的极端可变性一致，提示bicycle蛋白可能靶向植物细胞中的多个分子靶标并/或已进化为逃避植物免疫监视。结构空间中的亚簇与理化空间中的分组并不对应，表明结构和理化性质在该家族内独立进化。总而言之，预测的高置信度bicycle蛋白结构数据集揭示了该效应蛋白家族在皂苷样折叠框架内的巨大结构多样性，为理解这种快速进化的蛋白家族在宿主-寄生虫互作中的作用机制提供了重要基础。尽管功能与结构之间的映射仍然难以捉摸，这种多样性本身可能正是bicycle蛋白高效操纵植物发育和规避宿主防御的基础。