整合蛋白质组学揭示MSH6调节BRCA1/2功能完备型卵巢癌中PARP抑制剂敏感性

《PLOS One》：Integrative proteomics reveals MSH6 to modulate PARP inhibitor sensitivity in BRCA1/2-proficient ovarian cancer

　　

卵巢癌仍然是全球妇科癌症相关死亡的主要原因。BRCA1/2缺陷是预测聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂（PARPis）敏感性的公认生物标志物。然而，新出现的证据表明，一部分BRCA功能完备的肿瘤也对PARPi治疗有反应，提示存在额外的分子机制。研究人员假设PARP1蛋白复合物的组成和多聚ADP-核糖基化（PARylation）介导的信号传导有助于BRCA功能完备型高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中的PARPi反应。研究人员在一组BRCA功能完备的卵巢癌细胞系中评估了PARPi反应，并确定了不同的敏感组和耐药组。使用rucaparib的化学蛋白质组学揭示了不同的PARP1复合物，包括敏感细胞中MSH6的更高富集。免疫共沉淀分析进一步证实了敏感和耐药模型之间PARP1–MSH6–PARP2复合物的差异组装。为了探索PARylation信号传导，研究人员使用可点击的NAD⁺类似物进行了ADP-核糖基化蛋白质组学，揭示了敏感和耐药细胞系之间不同的PARylation谱。CHAF1A（一种已知的MSH6相互作用蛋白和PARP1底物）在PARPi敏感细胞中显示出更明显的ADP-核糖基化减少。使用CRISPR或siRNA靶向MSH6可降低PARPi敏感性。此外，在rucaparib处理后，mTOR信号在敏感细胞中降低，但在耐药细胞中升高。值得注意的是，无论是否使用rucaparib治疗，MSH6敲低都会导致CHAF1A表达增加。重要的是，敲低CHAF1A显著损害细胞活力，尤其是在A2780细胞中，并抑制mTOR信号，表明CHAF1A在MSH6下游发挥作用以调节mTOR轴。此外，与mTORC1抑制剂联合治疗增强了耐药细胞中rucaparib的细胞效应，表明靶向下游mTOR效应子以克服内在耐药的治疗潜力。总之，本研究确定了PARP1–MSH6相互作用通过CHAF1A-mTOR信号调节BRCA功能完备型卵巢癌中的PARPi敏感性。通过整合化学蛋白质组学和ADP-核糖基化蛋白质组学，研究人员描绘了PARP1复合物组成与信号动态之间的相互作用，强调MSH6是PARPi反应的关键调节因子，也是增强BRCA功能完备型HGSOC治疗疗效的潜在生物标志物。

卵巢癌（ovarian cancer, OC）仍是最致命的妇科恶性肿瘤之一。BRCA1/2功能缺失可导致同源重组修复缺陷（homologous recombination repair deficiency, HRD），是预测聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂（PARP inhibitor, PARPi）敏感性的公认生物标志物。然而，部分BRCA功能完备（即不存在BRCA1/2突变或基因组缺失）的卵巢肿瘤同样能从PARPi治疗中获益，其机制尚未阐明。以往研究发现PARP1相关蛋白复合物组成和多聚ADP-核糖基化（PARylation）信号可能参与调节PARPi反应，但缺乏系统研究。为此，研究人员在12种BRCA功能完备的OC细胞系和1种永生化输卵管上皮细胞系中评估了PARPi敏感性，并整合化学蛋白质组学与ADP-核糖基化蛋白质组学，探索差异敏感性的分子基础。相关成果发表在《PLOS One》。

主要技术方法包括：①基于固相化rucaparib类似物的化学蛋白质组学，结合竞争性亲和纯化与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），鉴定PARP1相互作用蛋白；②利用6-炔基腺苷（6Yn）和2-炔基腺苷（2Yn）探针进行代谢标记，经点击化学和亲和富集后，采用串联质量标签（tandem mass tag, TMT）定量，开展ADP-核糖基化蛋白质组学；③通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）和免疫印迹验证蛋白复合物；④使用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）和CRISPR-Cas9进行基因沉默/敲除；⑤采用细胞活力、克隆形成和Bliss协同模型评价药物效应。细胞系来源包括美国典型培养物保藏中心（ATCC）、Millipore Sigma以及多位研究者（如Dr. Andrew Godwin等）馈赠；所有细胞系经短串联重复序列（short tandem repeat, STR）鉴定。

结果如下：

1. BRCA功能完备的卵巢癌细胞对PARPi表现出广泛的敏感性范围。通过10天克隆形成实验检测奥拉帕利、rucaparib和尼拉帕利处理后的细胞存活，发现不同细胞系IC₅₀差异显著；以rucaparib最大血药浓度（C_max=1.94μM）为参照，约三分之二的细胞系在临床相关浓度下耐药。据此选定敏感代表细胞系A2780、OVCAR8、Caov3和耐药代表细胞系HEYA8、SKOV3、OVCA432进行研究。

2. PARP1在PARPi敏感和耐药OC细胞中与PARP2和MSH6形成差异蛋白复合物。化学蛋白质组学显示，PARP1、PARP2和错配修复蛋白MSH6在敏感细胞中共同富集，而耐药细胞主要富集PARP1/CTNND1复合物。免疫共沉淀证实，PARP1-MSH6-PARP2复合物在敏感A2780细胞中丰度高于耐药HEYA8细胞，且rucaparib处理增强其在敏感细胞中的组装。

3. CHAF1A被ADP-核糖基化并在PARPi敏感OC细胞中优先与PARP1和MSH6相互作用。ADP-核糖基化蛋白质组学筛选出CHAF1A、LSM12、RPP30、FHOD1等蛋白在敏感细胞中ADP-核糖基化水平较高，且rucaparib处理后降低；免疫印迹确认CHAF1A的ADP-核糖基化在A2780中高于HEYA8。进一步co-IP显示，rucaparib促进A2780细胞中PARP1/MSH6/CHAF1A复合物形成，而在HEYA8中减少。

4. MSH6表达与药物敏感性相关。基于CPTAC数据库的蛋白质组分析显示，卵巢肿瘤组织中MSH6和PARP1蛋白水平均显著高于正常组织，且两者表达正相关。Kaplan-Meier生存分析发现，在接受含紫杉醇或铂类化疗的患者中，MSH6高表达与较好总生存（overall survival, OS）相关。免疫印迹也显示PARPi敏感细胞系中MSH6和PARP1蛋白水平较高。

5. MSH6沉默导致PARP抑制剂耐药。在A2780和Caov3细胞中，采用siRNA或CRISPR-Cas9敲低/敲除MSH6后，细胞在rucaparib处理下的存活率显著回升，提示MSH6是PARPi敏感性的正向调节因子。

6. MSH6缺失诱导mTOR生存信号。MSH6敲低增加了mTOR及其下游S6的磷酸化，同时上调CHAF1A表达；rucaparib在敏感细胞中抑制mTOR信号，而在耐药细胞中激活该信号。CHAF1A敲低可显著抑制细胞活力、诱导凋亡和DNA损伤，并降低mTOR信号。在耐药HEYA8细胞中，mTORC1抑制剂雷帕霉素、依维莫司或S6激酶抑制剂LY2584702与rucaparib联合表现出协同效应。

讨论指出，PARPi敏感细胞的特征性分子事件是PARP1-MSH6-CHAF1A复合物形成及CHAF1A的高水平ADP-核糖基化；PARPi通过抑制该修饰阻止敏感细胞启动适应性mTOR生存信号。耐药细胞则通过补偿性激活mTOR信号产生内在耐药。MSH6可能发挥非经典错配修复（mismatch repair, MMR）功能，因为化学蛋白质组学未检测到MSH2的富集。研究结论认为，PARP1-MSH6相互作用通过CHAF1A-mTOR信号轴调节BRCA功能完备型卵巢癌的PARPi敏感性；MSH6表达或PARP1-MSH6复合物可作为预测PARPi反应的潜在生物标志物，联合PARPi与mTORC1抑制剂可能是克服内在耐药的有前景策略。该研究为扩展PARPi临床应用提供了新的蛋白质组学依据。