《PLOS Biology》：No evidence for modulation of the readiness potential by respiratory phase during natural breathing
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呼吸过程日益被认为在塑造神经活动和行为中发挥作用。近期研究报道了呼吸相位与皮层准备电位（RP）之间的耦合，提示呼吸可能调节自发动作之前的神经过程。本研究利用脑电图（EEG）记录，使用原始数据集、一个新的独立数据集以及不存在耦合的模拟数据，重新检验了这一论断。
呼吸过程日益被认为在塑造神经活动和行为中发挥作用。近期研究报道了呼吸相位与皮层准备电位（RP）之间的耦合，提示呼吸可能调节自发动作之前的神经过程。本研究利用脑电图（EEG）记录，使用原始数据集、一个新的独立数据集以及不存在耦合的模拟数据，重新检验了这一论断。研究结果显示，所报道的关联源于一个混杂因素：RP幅度和呼吸相位均与动作起始时间耦合。原始分析未控制这种依赖关系，导致产生在模拟数据中同样可观察到的虚假效应。当依据动作发生时的呼吸相位对试验进行分组以控制这一混杂因素时，表观耦合消失。跨数据集比较中，贝叶斯分析提供了自然呼吸条件下不存在效应的证据。这些发现表明，在自发行为期间呼吸相位并不直接调节RP幅度。更广泛地看，本研究揭示了将相位-幅度耦合分析应用于具有缓慢变化信号的分段数据时的缺陷，并强调了在解释生理-神经关系时控制共同依赖性的重要性。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
近年来，生理节律对神经活动和行为的影响日益受到关注。呼吸作为最基础的生命节律之一，已被多项研究提示与皮层活动及行为表现存在关联。具体而言，已有研究报告了呼吸相位与自发动作时间之间的耦合现象，即人们倾向于在呼气相而非吸气相启动自发动作。更进一步的论点认为，呼吸相位还直接调制准备电位（readiness potential，RP）的幅度——RP作为自发动作前约1-2秒开始出现的缓慢负向皮层电位偏移，被认为是动作准备过程的重要神经标志。这些发现被整合到“运动竞争假说”框架之中，该假说认为呼吸过程与自发运动过程共享或竞争相同的神经资源。一些研究进一步主张呼吸相位与RP幅度之间存在直接的因果关系。
然而，现有研究在RT-PCR检测方法上存在一个关键的方法学漏洞：RP幅度本身与动作起始时间密切耦合——越接近动作发生时刻，RP幅度越大。与此同时，呼吸相位也与动作起始时间存在耦合。因此，如果不对这一共同依赖关系进行控制，观察到的“呼吸相位-RP幅度”耦合可能仅仅是两者各自与动作起始时间关联的假象。基于这一推理，本研究旨在系统检验以下问题：在严格控制呼吸-行为耦合这一混杂因素之后，自然呼吸相位是否仍然直接调制RP幅度？
**研究设计与方法**
研究人员开展了三项相互补充的研究。第一，他们重新分析了Park等人（2020）报告的原始数据集（N=52），该数据集包含两个自发按钮按压实验的EEG和呼吸信号记录。第二，他们新收集了一个独立数据集，招募17名参与者（3名男性，14名女性；年龄19-34岁，平均23.6岁）完成经典Libet范式任务，使用64导联EEG系统（ActiChamp Plus放大器，采样率2500Hz）记录脑电信号，同时使用呼吸带记录呼吸信号，并同步采集右手第一背侧骨间肌的表面肌电信号。第三，他们生成了50个模拟数据集，每个数据集包含100次试验，其中的伪RP设置为2秒内线性积累至-4μV，呼吸相位为4秒周期的循环线性信号，且模拟数据中明确不包含RP-呼吸相位耦合。
在数据分析方法上，研究人员采用了两种不同的分箱策略。原始分箱策略沿用了Park等人（2020）的方法，即在每次试验内根据呼吸相位将EEG幅度分配到六个相位箱（吸气开始、中间、结束，呼气开始、中间、结束）中。校正分箱策略则根据动作发生时刻的呼吸相位对试验进行分组，从而在组间等同化呼吸-行为耦合的影响。两种方法均使用调制指数（modulation index，MI）作为耦合强度的统计量，并通过置换检验评估显著性。此外，研究人员还采用贝叶斯配对样本t检验（默认柯西先验，尺度参数0.707）来量化零效应（即不存在耦合）的证据强度，报告零假设的贝叶斯因子BF01。
**研究结果**
**自发动作时间与呼吸相位的耦合**：研究人员首先验证了自发动作起始时间与呼吸相位之间的关联。使用希尔伯特变换计算瞬时呼吸相位后，采用Hodges-Ajne环形均匀性检验及相位置换检验（1000次置换），在原始数据集和新收集数据集中均观察到了显著的行为耦合效应（置换检验，p=0.003），即参与者倾向于在呼气相按下按钮。该行为效应与Park等人（2020）及近期复现研究的结果一致。
**RP幅度与呼吸相位的耦合**：使用原始分箱方法分析时，研究人员在原始数据集（置换检验，p<0.001）和新收集数据集（置换检验，p<0.001）中均成功复现了RP-呼吸相位耦合效应。然而，当对同样包含呼吸-行为耦合但明确不存在RP-呼吸耦合的模拟数据应用相同分析时，模拟数据同样表现出显著的耦合效应（图1H），这明确提示原始分析方法产生了虚假发现。
**校正分箱后的结果**：当采用校正分箱方法（依据动作发生时刻的呼吸相位对试验进行分组）后，新收集数据集中未观察到显著耦合效应（置换检验，p=0.270），原始数据集中的效应也不显著（置换检验，p=0.059），且该趋势在排除异常值后完全消失。模拟数据在校正方法下正确显示了预期的均匀分布。
**贝叶斯分析**：由于置换检验的不显著结果本身不能作为零效应存在的证据，研究人员进行了贝叶斯分析以量化证据。对于原始数据集，BF01=4.713（后验中位数0.110，95%可信区间[-0.153, 0.375]）；对于新收集数据集，BF01=3.316（后验中位数-0.135，95%可信区间[-0.584, 0.301]）。两个数据集的贝叶斯因子均提供了中等强度的零效应证据。补充分析中，按吸气和呼气相位划分为不均衡分箱后，原始数据BF01=3.965，新数据BF01=3.002，同样支持零效应。
**讨论与结论**
本研究的核心发现表明，先前报道的RP-呼吸相位耦合效应源于一个混杂因素：RP幅度和呼吸相位均与动作起始时间耦合。当采用校正分箱方法控制呼吸-行为耦合后，RP-呼吸耦合效应在原始数据集、新收集数据集和模拟数据中均消失。贝叶斯分析为不存在直接耦合提供了中等强度证据。
本研究在方法学层面揭示了一个重要问题：将相位-幅度耦合分析（phase-amplitude coupling，PAC）应用于具有缓慢变化信号的分段数据时可能产生虚假结果。调制指数（MI）的计算假设被分析信号的周期短于分析窗口长度，以确保所有相位箱均被充分采样。但在RP分析中，EEG的缓慢负向漂移与动作起始时间锁定时，原始分箱方法所引入的非随机抽样偏差可能导致虚假的相位-幅度耦合。研究人员的模拟实验明确证明了这一点——本无耦合的数据在原始分析方法下表现出显著的“耦合”效应。
此外，讨论部分还指出，近期关于主动控制呼吸相位调制RP幅度的研究结果不能直接推广至自然呼吸条件。主动呼吸涉及补充运动区（SMA）和前额叶网络的参与，这些网络本身也参与自发运动生成，因此引入的额外认知控制需求可能独立地调制RP。此外，吸气时相较短可能产生时间紧迫感，而时间压力已知会影响RP的幅度和斜率。
**结论**：本研究确认了呼吸相位与自发动作时间之间存在行为耦合，但否定了呼吸相位直接调制RP幅度的假设。先前报道的RP-呼吸耦合是由两者各自与动作起始时间耦合所产生的假象。该发现呼吁在应用相位-幅度耦合分析时注意控制混杂因素，并强调开放科学实践在增强研究结论稳健性和可重复性方面的重要性。未来研究需要采用因果干预方法（如无意识呼吸夹带或脑刺激调节皮层兴奋性），以明确检验自然呼吸和RP在自发动作时间决策中的因果作用。
