基于肿瘤相关粘蛋白-1糖肽的偶联疫苗在自发性小鼠乳腺癌模型中的有效肿瘤保护

《ACS Chemical Biology》：Effective Tumor Protection by a Tumor-Associated Mucin-1 Glycopeptide-Based Conjugate Vaccine in a Spontaneous Mouse Breast Cancer Model

　　

人粘蛋白-1 (MUC1) 因其在肿瘤细胞上的高表达水平以及在肿瘤发展中的重要作用，是一种有吸引力的肿瘤抗原。由于肿瘤细胞上MUC1的异常糖基化，肿瘤相关MUC1 (tMUC1) 在肽骨架上附有缩短的O-连接糖链，从而区别于正常细胞上的对应物。基于tMUC1的疫苗候选物的临床前评估通常涉及对无肿瘤小鼠进行免疫接种。然而，肿瘤发展通常与免疫抑制相关。为了更好地模拟癌症治疗中遇到的临床条件，研究人员通过将小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV)-多瘤中T (PyMT) 小鼠与人MUC1转基因 (MUC1.Tg) 小鼠杂交，构建了乳腺癌小鼠模型。所得雌性双转基因小鼠 (MUC1/MMTV) 从6周龄开始自发发展出可触知的乳腺癌。研究人员在MUC1/MMTV小鼠中评估了一种有前景的疫苗候选物，该候选物由包含Thomsen-nouveau (Tn) 抗原的短9氨基酸tMUC1糖肽与噬菌体Qβ偶联而成。该疫苗被发现具有免疫原性，能够诱导高水平的抗tMUC1 IgG抗体应答。从糖肽微阵列研究解读得出，这些抗体对tMUC1的聚糖和肽序列均具有选择性。此外，诱导的抗体以MUC1依赖性方式结合肿瘤细胞，并可通过补体依赖性细胞毒性杀伤一系列肿瘤细胞。使用Qβ-tMUC1偶联物进行疫苗接种显著延长了MUC1/MMTV小鼠的生存期，83%的经治疗MUC1/MMTV小鼠存活时间超过对照组。Qβ-tMUC1疫苗在侵袭性且快速生长的自发性肿瘤模型中显示出有希望的结果，为其向人类患者的临床转化奠定了基础。

**论文解读**

**研究背景与问题**

粘蛋白-1 (MUC1) 是一种高分子量膜结合糖蛋白，在正常组织中表达于极性上皮细胞顶端，但在多种肿瘤细胞中表达高度上调（常超过正常上皮10倍），并且失去极性。同时，肿瘤细胞上的MUC1糖基化异常，产生缩短的O-连接糖链，暴露蛋白骨架，形成肿瘤相关MUC1 (tMUC1)。tMUC1在肿瘤发展中发挥重要作用，如促进增殖、增强侵袭转移和减少凋亡，被美国国立癌症研究所评为顶级肿瘤相关抗原。基于tMUC1的癌症疫苗开发具有潜力，但现有临床前评价多采用预防性疫苗接种后再接种肿瘤的异种移植模型，这些模型无法模拟肿瘤发展过程中伴随的免疫抑制环境，也无法反映人类肿瘤的遗传和组织学复杂性。因此，需要在更接近临床条件的模型中评估疫苗效力，以促进临床转化。

**研究内容与结论**

研究人员构建了临床相关的自发性乳腺癌模型：通过将MMTV-PyMT小鼠与MUC1转基因小鼠杂交，获得MUC1/MMTV双转基因雌性小鼠，这些小鼠从6周龄开始自发产生可触知的乳腺癌，模拟人类三阴性乳腺癌，具有快速进展和免疫耐受的特点。基于此模型，研究人员合成了包含Tn抗原（N-乙酰半乳糖胺，GalNAc）的短糖肽SAPDT*RPAP（*表示O-连接聚糖），并将其与噬菌体Qβ病毒样颗粒偶联，制备了Qβ-tMUC1偶联疫苗。使用单磷酰脂质A (MPLA) 作为佐剂，对2-3月龄的MUC1/MMTV小鼠进行皮下免疫（一次初免，四次加强，每次4 nmol tMUC1）。结果显示：该疫苗诱导了高水平的抗tMUC1 IgG抗体（平均滴度2.9×10⁶ ELISA单位），与MMTV小鼠（无MUC1耐受）的应答水平相当。通过MUC1糖肽微阵列分析，发现抗体特异性识别Tn修饰的PDTR区域，而对其他糖型（如Tf抗原、核心2四糖）或不同糖基化位点的结合显著降低，表明抗体对MUC1肽骨架和聚糖结构均有选择性。流式细胞术检测表明，免疫后血清能够以MUC1依赖性方式结合多种MUC1阳性肿瘤细胞（B16MUC1黑色素瘤、PANC-02-MUC1胰腺癌、ZR-75-1乳腺癌），而对MUC1阴性细胞结合弱。补体依赖性细胞毒性 (CDC) 实验显示，免疫后血清对MUC1阳性肿瘤细胞的杀伤率显著高于对照组。在肿瘤负担分析中，23周龄时，Qβ-tMUC1免疫的MUC1/MMTV小鼠肿瘤负担显著低于MMTV小鼠或对照组，且83%的免疫组小鼠存活，而对照组仅14%存活。结论：Qβ-tMUC1疫苗在自发性侵袭性乳腺癌模型中能有效延缓肿瘤发展并延长生存，强调tMUC1抗原的关键作用，为临床转化奠定基础。该论文发表在《ACS Chemical Biology》。

**主要关键技术方法**（不超过250字）

1. **自发性乳腺癌模型构建**：通过MMTV-PyMT小鼠与MUC1.Tg小鼠杂交，获得MUC1/MMTV双转基因雌性小鼠（样本队列来源：上述杂交后代）。2. **糖肽合成与疫苗制备**：采用Fmoc固相合成法合成含Tn抗原的tMUC1糖肽SAPDT*RPAP，经双功能连接子（己二酸双(4-硝基苯基)酯）偶联至Qβ病毒样颗粒（含A38K/A40C/D102C突变），平均每个Qβ颗粒修饰280个糖肽。3. **免疫方案**：皮下注射，佐剂为MPLA，每只小鼠每剂4 nmol tMUC1，共5次（第0、7、14、21、28天）。4. **抗体分析**：ELISA检测抗tMUC1 IgG滴度；MUC1糖肽微阵列（含87种糖肽）分析抗体特异性。5. **细胞结合与功能**：流式细胞术检测血清与MUC1阳性肿瘤细胞（B16MUC1、PANC-02-MUC1、ZR-75-1）及阴性对照（B16F10）的结合；CDC实验（MTS法）检测补体介导的肿瘤细胞杀伤。6. **肿瘤负担与生存分析**：每周两次测量肿瘤面积（长×宽），计算三个最大肿瘤平均面积，当最大肿瘤面积>200 mm²或体况恶化时实施安乐死，记录生存期。

**研究结果**

**1. Qβ-tMUC1免疫诱导显著抗tMUC1 IgG抗体应答**
通过ELISA检测（以BSA-tMUC1为包被抗原），MUC1/MMTV和MMTV小鼠免疫后均产生高效价IgG抗体，平均滴度分别为2.9×10⁶和1.9×10⁶ ELISA单位，而对照组（Qβ或PBS）滴度低于2000，证明疫苗免疫原性强且不受MUC1免疫耐受显著影响。

**2. 抗体对tMUC1糖肽的选择性识别**
利用含87种不同糖基化模式的MUC1糖肽微阵列分析，免疫血清主要结合在PDTR区域携带Tn抗原的糖肽（如P51、P53、P55、P56），而对其他糖型（Tf抗原、核心2四糖）或不同糖基化位点（如HGVT区域）结合显著降低，表明抗体特异性识别Tn修饰的PDTR表位，这是关键保护性表位。

**3. 抗体与MUC1表达肿瘤细胞的结合**
流式细胞术显示，免疫后血清（来自MUC1/MMTV或MMTV小鼠）与B16MUC1、PANC-02-MUC1、ZR-75-1等MUC1阳性细胞结合显著增强，而与MUC1阴性B16F10细胞结合弱，证明抗体以MUC1依赖性方式结合肿瘤细胞。值得注意的是，MMTV小鼠（无MUC1耐受）血清的肿瘤细胞结合能力更强，提示MUC1耐受可能限制抗体库的多样性。

**4. 补体依赖性细胞毒性**
CDC实验表明，Qβ-tMUC1免疫的MUC1/MMTV小鼠血清在补体存在下对B16MUC1和ZR-75-1细胞的裂解率显著高于对照组（Qβ或PBS），证明疫苗诱导的抗体能通过补体介导杀伤肿瘤细胞。

**5. 肿瘤负担与生存分析**
在23周龄时，Qβ-tMUC1免疫的MUC1/MMTV小鼠肿瘤负担（三个最大肿瘤平均面积）显著低于MMTV小鼠或对照组，且83%的免疫组小鼠存活，而对照组仅14%存活。对于MMTV小鼠（无tMUC1抗原），免疫组与对照组肿瘤负担无差异且无小鼠存活，进一步证实tMUC1抗原靶向在保护中的关键作用。不同剂量（4 nmol vs 8 nmol）的免疫应答相似。

**讨论与结论**

结论部分翻译：在本研究中，研究人员评估了Qβ-tMUC1疫苗在MUC1/MMTV小鼠中的效力。由于这些雌性小鼠全部自发发展乳腺癌，该模型相比异种移植乳腺癌模型能更接近模拟人类条件。对2-3月龄MUC1/MMTV小鼠进行免疫，诱导了强效的IgG应答和针对多种MUC1表达肿瘤细胞（B16MUC1、PANC-02-MUC1、ZR-75-1）的强肿瘤细胞结合能力。免疫后血清通过CDC对MUC1阳性肿瘤细胞（B16MUC1和ZR-75-1）的杀伤活性显著高于Qβ免疫的MUC1/MMTV小鼠。两种剂量（4和8 nmol）的tMUC1诱导了相似的免疫应答。Qβ-tMUC1免疫的MUC1/MMTV组小鼠肿瘤负担显著降低，83%的免疫小鼠存活超过相应的MMTV小鼠。这些结果强调肿瘤相关抗原tMUC1在延缓肿瘤发展和最终延长Qβ-tMUC1免疫MUC1/MMTV小鼠总生存期中发挥了关键作用。tMUC1序列SAPDT*RPAP（*表示Tn抗原）先前已被证明通过将抗体应答导向免疫耐受MUC1转基因小鼠中的关键保护性MUC1表位，是优于其他更长肽骨架的MUC1糖肽的抗原。其作为免疫治疗工具在侵袭性快速生长的自发性MUC1/MMTV肿瘤模型中的有效性，为未来临床转化奠定了基础。