DHODH抑制剂JNJ-6665的工艺开发

《ACS Organic & Inorganic Au》：Process Development toward DHODH Inhibitor JNJ-6665

　　

JNJ-6665是一种二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase, DHODH）抑制剂，已推进至首次人体（first-in-human, FIH）研究阶段。研究人员开发了一条汇聚式、无色谱纯化的制造路线，利用三唑酮5和异喹诺酮10的区域选择性SNAr偶联反应。三唑酮5通过使用催化量1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯（TBD）的安全三步串联（telescoped）工艺制备，以83%的总收率获得极高纯度物料。异喹诺酮10则经由钯催化的α-芳基化反应，再经串联水解/胺化步骤获得。5与10的偶联在相转移催化剂作用下进行，最终脱苄基后以91–92%的分离收率和99.2–99.6面积%纯度得到JNJ-6665，从而支持了稳健的药品生产质量管理规范（GMP）生产批次，用于GLP毒理学研究和FIH临床研究。

**DHODH抑制剂JNJ-6665的工艺开发解读**

**一、研究背景与问题**

成人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种骨髓产生大量异常血细胞的恶性肿瘤。虽然标准诱导化疗可使部分患者获得缓解，但复发患者的5年总生存率低于30%。二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase, DHODH）是一种黄素依赖性线粒体酶，催化嘧啶生物合成途径中的第四步反应，即将二氢乳清酸转化为乳清酸。自1959年证实DHODH在肿瘤进展中的作用以来，DHODH抑制剂用于癌症治疗的研究受到广泛关注。

化合物1（JNJ-6665）被选入1期临床试验，最初通过11步路线合成，总收率约6%。随后，发现工艺研究（Discovery Process Research, DPR）与外部开发和供应（External Development and Supply, EDS）团队紧密合作，开发了非GMP路线：以酯2为起始原料，经肼解、与异氰酸乙酯反应及NaOH关环得到三唑酮5（三步串联，收率91%）；5与2-溴-4,5-二氟苯甲酸甲酯6发生SNAr反应得到中间体7；随后经钯催化α-芳基化生成3-羟基异色满-1-酮8；8与邻甲苯胺在乙酸中反应得到异喹诺酮9，再经三氯化硼脱苄基得到化合物1（三步收率56%，纯度>98%）。该第二条路线总收率提升至约46%，为早期开发批次提供了物料。

然而，该路线在放大过程中暴露出若干局限：路线为线性合成，且由于反应纯度中等，需要多次色谱纯化；同时需要更稳健的结晶工艺以确保固体形态的可靠控制。这些挑战促使研究人员开发适用于多千克规模生产的第三代GMP路线，以支持GLP毒理学研究和临床试验。研究人员为此设计了汇聚式合成策略：将已知中间体5与由异香豆素11衍生的异喹诺酮10进行偶联，高效制备目标化合物1。

**二、主要关键技术方法**

本研究为工艺开发，不涉及患者样本队列。关键方法包括：①三唑酮5制备采用催化量1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯（TBD）促进的三步串联反应，在室温条件下仅需1.05当量水合肼；②异喹诺酮10的合成核心是钯催化α-芳基化反应，以乙酸钯二聚体/Xantphos为催化剂、K₃PO₄为碱、4?分子筛为除水剂，随后经LiOH水解与乙酸/邻甲苯胺一锅串联胺化；③关键SNAr偶联采用Cs₂CO₃与相转移催化剂四丁基硫酸氢铵（Bu₄NHSO₄）在N,N-二甲基乙酰胺（DMA）中进行；④终末脱苄基在室温下以BCl₃的CH₂Cl₂溶液进行。

**三、研究结果**

**1. 三唑酮5的安全串联工艺。** 研究表明，0.05当量的TBD可在室温下促进反应，且仅需1.05当量肼；同时乙醇用量由10 L/kg降至3 L/kg，避免了浓缩步骤。在0–5 °C加入异氰酸乙酯后，20 °C搅拌2 h即可完全转化为4；加入NaOH后于90–100 °C搅拌12 h生成三唑酮5，调节pH至6可直接从反应液中析出。此优化抑制了分离过程中因肼过量分解导致的剧烈氮气释放。放大结果表明，5的液相色谱纯度（LCAP）>99.9%，三步总收率83%，工艺质量强度（PMI）降低45%。

**2. 钯催化α-芳基化反应条件筛选。** 研究人员以溴代酯6与异戊醛为底物筛选碱和分子筛用量。结果显示，Cs₂CO₃可生成81 LCAP的异香豆素11，而Li₂CO₃和叔戊醇钠效果差；K₃PO₄将11的纯度提升至88 LCAP，被选为进一步优化对象。无4?分子筛时反应16 h仅95%转化，且水合物12与甲醚13大量生成；100 w/w%分子筛可完全转化但12和13仍有残留；200–300 w/w%可将12控制在1 LCAP以下，11以77–81 LCAP生成，测定收率（AY）73–75%。综合考量后选择200 w/w%分子筛和2.0当量醛用于放大。后处理采用NaHSO₃洗涤，并以N-乙酰半胱氨酸/K₃PO₄水溶液除钯。

**3. 异喹诺酮10的合成。** 以11为原料直接制备10的尝试失败，于是采用两步串联：先水解为水合物12。碱与溶剂筛选显示，LiOH在EtOH/H₂O体系中可将12的LCAP提升至99.0且不产生二酸14。12经2-MeTHF萃取、转溶至乙酸后，加入1.1当量邻甲苯胺于60 °C反应16 h，以95 LCAP得到异喹诺酮10。粗品经乙醇重结晶后纯度达99.3 LCAP，残留钯<4 ppm，三步总收率56%。

**4. 关键SNAr偶联反应优化。** 首先以DMF为溶剂考察碱：Cs₂CO₃给出93.7 LCAP的目标产物9，且区域专一；K₂CO₃转化不完全，加水后速率更低；t-BuOK、NaOH和Et₃N效果差。为避免DMF，研究人员筛选了t-BuOH、IPA、MeCN和环丁砜，转化率均约70%；而NMP和DMA分别得到96.6和95.3 LCAP的9。考虑到DMA沸点低、水洗易除，选为最终溶剂。稳定性研究显示，异喹诺酮10在70–75 °C碱性条件下16 h后开始分解，因此反应温度降至50–55 °C，并改用微过量的10（1.02当量）来确保三唑酮5完全消耗。加入催化量Bu₄NHSO₄后，22 h内得到90–95 LCAP的9；经MTBE/正庚烷结晶，9的分离收率87%，纯度98.7 LCAP。

**5. 脱苄基与终产物分离。** 研究人员采用反向加料方式，将9的CH₂Cl₂溶液于15–25 °C滴加到4.3当量BCl₃的CH₂Cl₂溶液中，避免低温条件。MeOH淬灭、水洗后溶剂置换为丁酮（MEK），以正庚烷为抗溶剂结晶，终产物1的分离收率91%，纯度99.2 LCAP，且获得目标固体形态。

**四、结论**

研究人员开发了一条合成DHODH抑制剂1的汇聚式路线，其核心是三唑酮5与异喹诺酮10之间的关键SNAr反应。三唑酮5通过更安全、改进的串联工艺制备，总收率83%，纯度>99.9 LCAP；关键中间体10经由无色谱串联工艺获得，从酯6出发三步收率56%，纯度99.3 LCAP；5与10在相转移催化剂介导下发生SNAr反应，得到前体9，分离收率87%，纯度>98 LCAP；最终采用BCl₃脱苄基，以91%的分离收率、99.6%的纯度和期望的固体形态交付最终原料药。三轮GMP生产中制造工艺的持续改进，确保了原料药的按时交付，支持了该项目的毒理学和临床研究。