复杂吩嗪的生物合成涉及由多功能核转运因子2样超家族蛋白催化的二聚化与氨化

《JACS Au》：Biosynthesis of Complex Phenazines Involves Dimerization and Amination Catalyzed by a Versatile Nuclear Transport Factor 2-like Superfamily Protein

　　

吩嗪类天然产物是一类结构多样的芳香族生物碱，具有广谱生物活性。在这些化合物中，吩嗪二聚体因其复杂的分子架构以及强效的抗菌和抗癌特性而备受关注。尽管核心吩嗪骨架的生物合成已被充分表征，但酶促翻译后修饰，尤其是生成结构多样的二吩嗪的二聚化过程，仍知之甚少。在本研究中，研究人员阐明了多种二聚化和氨化吩嗪的完整生物合成途径。在核心组装之后，黄素蛋白DapS通过催化吩嗪-1,6-二羧酸(PDC)的C6选择性脱羧羟化反应启动后修饰。研究人员进一步发现，核转运因子2(NTF2)样蛋白Dap5是一种多功能酶，可催化吩嗪的羟化、二聚化和氨化反应。引人注目的是，Dap5的催化活性不依赖黄素或金属辅因子，而是利用酶-底物复合物中吩嗪底物的氧化还原循环来激活氧。基于蛋白模型的结构和对接分析表明，这些反应可能共享一个预测的共同活性位点空腔，但采用不同的残基网络进行底物结合和催化。本研究解决了二聚吩嗪生物合成中一个长期存在的谜团，展示了一种独特的底物辅助自由基策略，为多功能酶的进化提供了新见解。

吩嗪类化合物是一类以三环二苯并吡嗪为核心骨架的芳香族生物碱，具有强效且广泛的生物活性。目前已鉴定的天然吩嗪超过200种，主要来源于假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)，其中仅少数含有两个吩嗪单元，以单键连接的二聚体或稠合系统形式存在，因其复杂的分子架构和显著的抗菌、抗癌活性而备受关注。虽然核心吩嗪骨架的生物合成已充分研究，但控制二聚化过程、生成结构多样的二吩嗪的酶促修饰机制仍不清楚，且精确控制区域和立体选择性的二聚吩嗪化学合成也面临挑战。2014年，Li等人从Streptomyces diastaticus中分离得到细胞毒性抗菌二聚吩嗪diastaphenazine(1)和C-N连接的izumiphenazine C(2)。研究人员前期的遗传分析表明dapS和dap5参与骨架修饰；Zhuang等人从Streptomyces sp. 06282-1I中表征了产生七种二聚吩嗪的BGC，含有保守的dapS和dap5同源基因，提示其功能在进化上保守。因此，阐明这些基因的功能对于揭示二聚吩嗪生物合成机制具有重要意义。

研究人员通过整合体内饲喂实验和体外酶学分析，证明了DapS和Dap5在多种吩嗪化合物（包括1、2、4和5）生物合成中的关键作用。其中NTF2样超家族蛋白Dap5展现出前所未有的多功能催化活性，可介导吩嗪的羟化、二聚化和氨化反应；该酶通过底物辅助自由基机制发挥作用，需要NAD(P)H作为外部电子供体，但无需金属离子或黄素辅因子参与。这项研究解决了二聚吩嗪生物合成中长期悬而未决的机制谜题，为发现和工程化多功能酶系统生产吩嗪衍生物建立了框架。该论文发表在《JACS Au》。

主要技术方法包括：在S. albus中异源表达dapS和dap5并进行体内饲喂实验；利用重组可溶性DapS同源物XpzG和Dap5进行体外酶活测定；采用HPLC、ESI-HRMS和NMR进行产物结构鉴定；使用¹⁸O₂和H₂¹⁸O进行稳定同位素标记实验；采用EPR自旋捕获技术检测自由基中间体；利用AlphaFold2进行蛋白结构预测和AutoDock Vina分子对接；通过定点突变验证关键催化残基；基于基因组挖掘鉴定Dap5同源蛋白。

研究结果如下。**DapS和Dap5参与多种复杂吩嗪化合物的生物合成。** 通过HPLC代谢物谱分析发现，表达dap BGC的S. albus除产生已知化合物1、2和PCA(3)外，还产生化合物4和5，分别鉴定为izumiphenazine A和phenazinolin D。基因缺失实验显示ΔdapS突变株积累PDC(6)，Δdap5突变株积累7和8（比例约10:1）。生物信息学分析将DapS归类为黄素蛋白，与已知吩嗪羟化