光催化邻近标记绘制RNA与蛋白质亚细胞分布图谱

《JACS Au》：Photocatalytic Proximity Labeling Maps RNA and Protein Subcellular Landscapes

　　

绘制亚细胞区室内部的分子分布图谱对于理解细胞功能至关重要。光催化邻近标记（photocatalytic proximity labeling, PhotoPL）已成为一种日益多样化的化学策略，用于在活体系统中探测生物分子微环境。然而，一个可轻松重靶向并用于捕获特定细胞器内蛋白质与RNA邻域的模块化小分子平台仍待发展。现有光催化方法针对生物分子标记采用了不同的探针激活模式。本文中，PhotoPL采用基于已确立的硒醚光氧化化学的氧化激活设计，构建于模块化细胞器靶向平台之上。该方法使用细胞器靶向光催化剂与可激活硒醚探针；可见光照射下，局域催化剂产生短寿命活性中间体，共价标记邻近生物分子。研究人员成功将PhotoPL应用于线粒体与内质网（endoplasmic reticulum, ER）的蛋白质组与转录组分析，验证了其对细胞器特异性分子的高保真捕获。不同于酶依赖方法，PhotoPL利用小分子组分，最小化细胞扰动；其关键优势在于模块化“即插即用”设计，无需繁琐基因克隆即可快速重靶向至新亚细胞位置。该模块化可扩展平台拓展了用于解析细胞分子组织及探索蛋白质与RNA在健康与疾病中互作的化学工具箱。

研究背景方面，细胞功能依赖于生物分子在细胞器与亚细胞结构中的精确区室化与动态组织，线粒体与内质网作为能量代谢、蛋白合成折叠、脂质代谢与钙信号枢纽，其蛋白质与RNA的协同定位及互作对稳态至关重要，而空间组织失调与神经退行、代谢病及癌症相关。传统亚细胞分级联合组学缺乏捕捉瞬态互作的空间分辨率，成像法通量低；酶基邻近标记（如APEX、BioID/TurboID及其RNA适配CAP-seq、Halo-seq）需稳定表达大融合蛋白、可能扰动内源系统且重定向需重新构建遗传载体，难以同时统一捕获蛋白与核酸；已有光催化策略（Ru/Ir基）虽多样，但缺乏将亚细胞靶向与探针设计解耦、以单一平台统一捕获蛋白与RNA的模块化架构。为此，研究人员开发PhotoPL，以活细胞可见光触发、将已确立的单线态氧介导硒醚氧化-硒氧化物消除化学整合入模块化细胞器靶向平台，实现线粒体与内质网蛋白组与转录组同步高分辨制图。该文发表于《JACS Au》。

主要关键技术方法上，研究人员构建含三组件的系统：细胞器靶向钌(II)多吡啶光催化剂（线粒体用TPP偶联Mito-Cat，内质网用对甲苯磺酰胺偶联ER-Cat）、带叠氮手柄的苯硒甲基苯酚硒醚探针、450–470 nm蓝光触发；以单线态氧（¹O₂）为介质经硒氧化物消除生成邻位醌甲基化物（o-quinone methide, QM）短寿命中间体，共价捕获邻近蛋白亲核残基（Cys、Lys、His等）与核酸鸟嘌呤N²/N⁷；标记后通过无铜点击化学偶联生物素富集或荧光成像。细胞实验采用HEK293T与HeLa细胞，优化催化剂4 μM、探针400 μM、光照15 min，并以碘乙酰胺阻断背景；活细胞定位用共聚焦显微镜与MitoTracker/ER-Tracker共标评估；组学端对富集RNA行qPCR与RNA-seq、对蛋白行链霉亲和素磁珠富集后Western blot与质谱，并以APEX数据集与RNALocal核定位转录本交叉评估假阳性；机制端以LC-MS/MS双通道（KHR/WCM）搜库定位BSA修饰位点；功能验证用衣霉素诱导内质网应激模型。

研究结果部分，按原文小节浓缩如下：

Principle and Validation of the Photocatalytic Proximity Labeling (PhotoPL) Strategy：研究人员筛选18个光敏剂，选定Ru(II)配合物Cat-10在蓝光下30 min近定量转化模型硒醚探针；厌氧中止、纯氧加速、DABCO淬灭¹O₂证实经单线态氧氧化硒醚→硒氧化物消除→QM路径；体外BSA与DNA寡核苷酸15 min光照即被叠氮探针标记，依赖催化剂/探针/光三者齐全；探针对位羧基引入叠氮便于点击；Mito-Cat/ER-Cat细胞毒性低。

Identification of Labeling Sites and Residue Selectivity：LC-MS/MS分析BSA，序列覆盖约88%，高置信修饰见于Lys、His、Arg、Trp、Cys，质量位移+350.159 Da，无Met氧化等¹O₂非特异损伤标志，邻近位点（K235/W237、H311/C312）修饰比一致指向单修饰，以Cys/His为主，证明QM介导邻近捕获而非弥散氧化。

High-Fidelity Subcellular Targeting and In-Cell Labeling：共聚焦显示Mito-Cat与MitoTracker Deep Red Pearson系数0.82、ER-Cat与ER-Tracker 0.79；4 μM/400 μM/15 min为最佳，IAM消背景；活细胞RNA与蛋白均见依赖光催化标记的荧光信号。

PhotoPL Captures Organelle-Specific Transcriptomes and Proteomes：HEK293T中Mito-PhotoPL富集MTND1、MTCO2，耗减GAPDH与SSR2；ER-PhotoPL富集SSR2、TMX1、SFT2D2。RNA-seq下ER-PhotoPL鉴出679个潜在ER RNA，与APEX的2468个交集121个，以RNALocal严格核转录本计假阳性率1.18%（APEX 0.49%）；蛋白组ER富集以ER腔最高，GO细胞组分吻合；Western blot磁珠富集条带干净、无光/无催化剂对照全阴。

Functional Insights into the ER Proteome and Stress Response：ER富集蛋白GO显示蛋白羟基化、ER应激响应、二硫键异构（PDIA4、P4HB、TXNL1）与二硫氧化还原（GLRX、SELENOT、SUMF1）显著；衣霉素（tunicamycin, TU）处理HeLa 8 h后CHOP上调、CANX不变，确认ER应激；PhotoPL富集显示PDIA4在应激下标记信号显著增强，表明平台可捕获细胞器微环境动态蛋白变化。

结论部分翻译：本研究开发PhotoPL，一具模块化架构的光催化邻近标记平台，将已确立的硒醚光氧化激活整合入细胞器靶向系统，以单一通用探针统一捕获蛋白与RNA。相较酶法，其用小分子催化剂与探针降低空间位阻与功能扰动，可见光提供时空控制，重定向仅需更换催化剂偶联配体而免克隆，实现线粒体与ER活细胞蛋白组与转录组同步制图。LC-MS/MS直接定位BSA亲核残基修饰、无Met氧化标志，证实质子邻近驱动QM捕获；未来可通过换配体拓展至核、溶酶体、高尔基体等。该化学控制、光触发策略为解析活细胞分子组织提供可扩展工具箱。

讨论总结上，研究人员指出PhotoPL的差异化不在于新化学反应而在于模块化平台架构：解耦靶向与探针、单探针双组学、小分子免克隆即插即用；局限在于探针递送效率与QM极短寿命虽抑扩散但仍需严控条件（催化剂/探针/光依赖、IAM阻断）；其结构模块化允许以Hoechst/NLS导向核染色质、 morpholine/ceramide导向溶酶体/高尔基体、偶联抑制剂导向特定内源蛋白互作组，并可通过长波长（红/近红外）催化剂拓展深层组织应用。整体而言，PhotoPL以高保真、低扰动、可扩展方式补足酶基与既往光催化方法短板，为亚细胞蛋白-RNA共图谱与疾病相关空间失调研究提供新基底。