《Journal of Proteome Research》：Integrated Proteomics and Metabolomics Can Shed Light on Potential Biomarkers of Inflammation and Infection in Chicken Embryos as an Experimental Model
编辑推荐：
沙门氏菌雏白痢（Salmonella Pullorum，SP）感染已被提出作为晚期鸡胚（chicken embryos，CEs）炎症的实验模型。研究人员通过尿囊接种低剂量SP至9.5日龄鸡胚，并在感染后24 h和48 h评估结果，对该模型进行了优化。该方法旨在
沙门氏菌雏白痢（Salmonella Pullorum，SP）感染已被提出作为晚期鸡胚（chicken embryos，CEs）炎症的实验模型。研究人员通过尿囊接种低剂量SP至9.5日龄鸡胚，并在感染后24 h和48 h评估结果，对该模型进行了优化。该方法旨在提供一个系统探索感染和炎症引发的早期分子事件的框架，同时将CE作为一种伦理上可接受且生物学相关的全身性炎症模型。研究评估了临床参数（死亡率和体重）、血清蛋白质组学和非靶向代谢组学。蛋白质组学采用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）进行，随后进行PANTHER和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析；代谢组学用于评估血清代谢物变化。感染后48 h死亡率增加（30%），存活胚胎显示出体重减轻的趋势。蛋白质组学分析显示，尽管存在高度零膨胀，感染组总体蛋白质浓度较对照组升高，其中α-2-巨球蛋白（α-2-macroglobulin）在48 h显著上调，表明存在内源性免疫应答。在通路水平富集方面，贝叶斯分析提示蛋白质组动态存在细微变化。代谢组学鉴定了时间依赖性变化，包括48 h时α-生育酚相关代谢物和苯丙氨酸来源代谢物水平升高，以及氧化脂肪酸衍生物水平降低。这些发现支持12日龄前CE模型作为研究急性炎症反应的伦理优化且敏感的系统。
**论文解读：整合蛋白质组学与代谢组学揭示鸡胚炎症模型的早期分子事件**
**一、研究背景与问题**
理解宿主对感染和炎症的系统性反应，特别是病原体暴露后早期分子事件的识别，是生物医学研究的关键目标。传统上，哺乳动物模型被广泛用于宿主反应研究，但出于动物福利和伦理研究实践的考量，科学界日益转向遵循替代、减少和优化（3Rs）原则的替代模型。鸡胚（chicken embryo，CE）模型除具有伦理优势外，在炎症研究中具备生物学相关性——多种炎症通路和急性期反应机制在脊椎动物中进化保守。从优化视角看，CE在疼痛感知完全建立之前的早期发育阶段即可用于研究宿主-病原体相互作用，具有低成本、高可及性和快速获得结果等实际优点。广泛认为12个发育日（days of embryonic development，DED）以下的胚胎因伤害性回路未成熟而不具备疼痛感知能力，因此12 DED之前的CE代表了研究感染和炎症全身性效应的生物学相关且伦理可接受的模型。尽管CE已在病毒学和毒理学中得到应用，但作为细菌感染炎症模型，特别是聚焦于全身性蛋白质组和代谢组变化的研究仍然有限。蛋白质组学分析能够检测蛋白质表达和功能活性的细微变化，为宿主反应的分子机制提供见解；然而胚胎组织蛋白质组研究面临分析挑战，如智利鸡（Gallus gallus）在现有数据库中功能注释有限。互补的代谢组学分析可捕获小分子代谢物的动态变化，提供细胞反应的更广阔视图，揭示蛋白质组数据中可能不明显的抗氧化、脂质和氨基酸通路的功能转变。
**二、研究设计与技术方法**
研究人员在巴西乌贝兰迪亚联邦大学（Federal University of Uberlandia）的孵化实验室、传染病实验室和纳米生物技术实验室开展实验，并经动物伦理委员会批准。研究使用80枚Hy-Line品系鸡胚，在9.5 DED时经尿囊腔接种100 μL 2 log CFU/mL的沙门氏菌雏白痢（Salmonella Pullorum，SP）作为阳性对照（PC），接种0.85%生理盐水作为阴性对照（NC）。在感染后24 h和48 h（即10.5和11.5 DED）评估死亡率、体重并采集脐静脉血。主要关键技术方法包括：基于液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）的血清蛋白质组学分析，采用高分辨率四极杆飞行时间质谱（Q-TOF）；基于高效液相色谱-质谱联用（HPLC–MS）的非靶向代谢组学分析；PANTHER分类系统和KEGG数据库用于功能富集分析；贝叶斯Tobit混合效应模型处理蛋白质组零膨胀和左删失数据；limma包结合经验贝叶斯调节进行代谢物差异丰度检验；主成分分析（PCA）、主坐标分析（PCoA）和PERMANOVA用于多元组成分析。质谱蛋白质组学原始数据已提交至ProteomeXchange联盟PRIDE数据库（PXD072137）。
**三、研究结果**
**鸡胚体重与死亡率**：感染后24 h无胚胎死亡；48 h时PC组20枚剩余胚胎中6枚死亡（30%），NC组死亡率为0%（0/20）。存活胚胎体重虽未达统计学显著差异，但p值极低（0.0506），提示感染组体重减轻的趋势。该趋势与胚体对SP病原性的免疫应答假设一致。
**蛋白质水平分析**：共鉴定24 h样本1,164个蛋白质，48 h样本1,463个蛋白质，两个时间点约90%的观测值为零。仅有5.76%（24 h）和56.6%（48 h）的蛋白质可通过PANTHER和KEGG数据库进行功能分类，反映了智利鸡注释数据库的局限性。
**感染后24小时**：贝叶斯Tobit模型估计感染组蛋白质浓度有小的正向效应（估计值=0.20，95% CI：[0.08，0.31]）。10个蛋白质具有较大绝对log2倍数变化且p<0.05，但多重检验校正后均不显著。通路、生物学过程和分子功能分析均未显示FDR校正后显著结果，PERMANOVA未检测到显著组间分离。
**感染后48小时**：整体蛋白质浓度在感染组显著升高（估计值=0.26，95% CI：[0.12，0.40]）。α-2-巨球蛋白样蛋白1（alpha-2-macroglobulin-like protein 1）表现出高度显著的生物学相关增加，log2倍数变化为13.13，FDR校正后仍显著（调整后p=0.0081），较对照组升高超过8000倍。其他蛋白质和功能类别在FDR校正后均未达显著。通路水平上，纤溶酶原激活级联、凝血、PPAR信号通路、碳代谢和丙酮酸代谢呈现名义显著（未调整p<0.05），但校正后不显著；线粒体自噬呈下调趋势。
**代谢物水平分析**：多元分析显示NC和PC组在24 h即存在部分分离，48 h分离更为显著（PERMANOVA：F=14.17，R2=0.381，p=0.001）。24 h时，α-CEHC（α-生育酚代谢终产物）显著升高，2R-羟基月桂酸和16-羟基-10-氧代十六烷酸等氧化脂肪酸衍生物显著降低。48 h时，苯乙醛（苯丙氨酸代谢产物）显著升高，α-CEHC和α-生育酚内酯持续升高，16-羟基-10-氧代十六烷酸持续降低。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，SP作为高毒力胚胎病原体在低剂量接种后48 h引起30%死亡率，证实细菌活性并提示部分胚胎启动了限制细菌增殖的免疫应答。α-2-巨球蛋白（A2M）在哺乳动物中是经典的急性期蛋白，由IL-6和TNF-α等先天免疫信号诱导，具有广谱蛋白酶抑制剂、细胞因子载体和免疫细胞活性调节功能。本研究首次报道A2M在鸡胚血液中响应感染而动态上调，且其上调时间与死亡率出现一致，提示其在胚胎炎症反应中发挥作用，可能作为炎症和疾病进展的生物标志物。尽管胚胎期适应性免疫尚未完全功能化，A2M的升高可能反映先天免疫激活。通路分析中纤溶酶原激活级联和凝血通路上调，与细菌感染引发炎症驱动的凝血级联一致；PPAR信号通路的激活可能反映调节炎症和维持代谢平衡的代偿机制；线粒体自噬下调可能损害线粒体质量控制，与胚胎发育干扰相关。代谢组结果支持感染相关的氧化应激挑战和维生素E依赖性抗氧化通路的激活。研究结论表明，12 DED前的CE是一个敏感且易处理的感染和炎症研究模型。蛋白质组学提示适度和时间结构的蛋白质丰度变化，代谢组学显示时间依赖性代谢谱转变，包括抗氧化通路激活和脂质介质重塑。多组学整合不仅增强了CE模型的敏感性和机制相关性，还支持其用于识别全身性炎症生物标志物和探索早期禽类免疫应答。这是首次在12 DED前表征CE血液蛋白质组变化的研究，也是首次将A2M与智利鸡胚胎或成年血液中的内源性免疫应答相关联的报告。
