重组和大肠杆菌W3110中O-琥珀酰-L-高丝氨酸生物合成途径的代谢调控

《Journal of Biotechnology》：Reconstruction and metabolic regulation of O-succinyl-L-homoserine biosynthesis pathway in Escherichia coli W3110

　　

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  采用了分层调控策略来增强OSH的生物合成。
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  增强和平衡关键前体对于高产OSH的产生至关重要。
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  构建的无质粒细胞工厂实现了迄今为止最高的OSH滴度。

引言

O-琥珀酰-L-高丝氨酸（OSH）是一种具有潜在应用价值和显著工业价值的前体化合物。它是多种平台化学品生物合成中的关键中间体，包括高丝氨酸内酯（HSL）、γ-丁内酯（GBL）、琥珀酸和1,4-丁二醇（BDO）（Hong等人，2014年）。OSH广泛应用于制药、农业、食品和其它领域（Cai等人，2023年）。L-甲硫氨酸是细胞增殖和分化所必需的氨基酸。作为其关键前体，OSH可以通过半胱硫氨酸-γ-合成酶的催化转化为L-甲硫氨酸，或者在与甲硫醇反应后，在O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫醇裂解酶的催化下直接生成L-甲硫氨酸和琥珀酸（Gabay等人，2024年；Tang等人，2023年）。随着全球对L-甲硫氨酸需求的增长，OSH的生物合成受到了广泛关注（Tang等人，2025年）。在大肠杆菌中，OSH的生物合成始于通过Embden Meyerhof Parnas途径（EMP途径）将葡萄糖转化为丙酮酸。丙酮酸进一步脱羧生成乙酰-CoA，随后通过TCA循环产生草酰乙酸，再经过一系列催化反应形成L-高丝氨酸。L-高丝氨酸在高丝氨酸-O-琥珀酰转移酶（HST，由基因metA编码）的催化下与琥珀酰-CoA反应生成OSH（图1）（Lee等人，2007年；Li等人，2016年）。此外，metA的表达受到转录抑制剂MetJ的严格调控，而HST的活性还受到L-甲硫氨酸的反馈抑制（Sagong等人，2022年）。

在之前的研究中，OSH的生产已取得进展。Liu等人通过调节TCA循环增强了琥珀酰-CoA的供应，获得了一种能够在摇瓶发酵中产生24.1 g/L OSH（0.61 g/g葡萄糖）的菌株（Liu等人，2021年）。Tang等人加强了L-天冬氨酸和L-高丝氨酸的前体合成途径，优化了戊糖磷酸和EMP途径以改善NADPH的供应，并采用适应性实验室进化来提高菌株的耐受性，结合在线拉曼光谱技术，最终在50-L生物反应器中实现了121.7 g/L的OSH滴度（0.61 g/g葡萄糖）（Tang等人，2025年）。Xu等人过表达了ppc、aspC、aspA和gdhA基因，优化了磷酸烯醇式丙酮酸-草酰乙酸途径以供应L-天冬氨酸，并引入质粒pTrc99A来调整metA和yjeH的启动子，最终在5-L生物反应器中实现了120.32 g/L的OSH滴度，产率为0.51 g/g葡萄糖，生产速率为1.18 g/L/h（Xu等人，2025年）。Niu等人利用核糖体结合位点（RBS）工程技术来平衡aspA和aspC在大肠杆菌 Nissle 1917中的翻译效率，在5-L生物反应器中最终获得了80.79 g/L的OSH滴度（Niu等人，2025a）。

尽管在OSH生物合成方面已经取得了相当大的进展，但其合成途径中基因表达的系统优化仍然不够充分。特别是从L-天冬氨酸到L-高丝氨酸的代谢途径及其相关竞争分支途径的调控和代谢工程尚未得到充分探索。这一限制在一定程度上限制了OSH的生物合成效率，导致大肠杆菌细胞工厂中OSH的发酵滴度和产量相对较低。因此，基于之前构建的工程菌株大肠杆菌 W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔlysA ΔmetB ΔthrB Trc-thrA Trc-metL（菌株OSHM0），本研究构建了一种无质粒的OSH生产菌株。首先，通过引入具有不同点突变的metA突变体筛选了关键酶HST。随后，通过敲除竞争性的有机酸途径来增强L-高丝氨酸（HS）的合成途径，然后通过启动子工程和RBS强度调控系统地工程化了从L-天冬氨酸到L-高丝氨酸（ASP-HS）的合成途径。接下来，采用动态调控策略来平衡琥珀酰-CoA的前体供应，并进一步改善了细胞内NADPH和ATP的供应水平。最终获得了一种无质粒、高产OSH的工程菌株OSHM40。该菌株在摇瓶发酵条件下的OSH滴度达到20.15 ± 0.21 g/L，在5-L生物反应器中的补料批次发酵条件下，滴度达到104.09 ± 2.06 g/L，糖酸转化率为64.99%，体积生产率为1.43 g/L/h。该菌株的OSH滴度和糖酸转化率在所有报道的无质粒菌株中最高，为这种工程菌株的工业应用奠定了重要基础。本研究涉及的所有遗传修饰均如图1所示。

章节片段

菌株和质粒

本研究中使用的重组大肠杆菌菌株和质粒列于表1中。质粒构建使用大肠杆菌 DH5α作为宿主菌株。pTarget、pCas和pTrc99A质粒分别用于基因组编辑和基因表达。

遗传操作

在大肠杆菌 W3110中进行的基因替换使用了CRISPR/Cas9系统，编辑模板包含500 bp的同源臂。编辑质粒通过化学转化引入，所有遗传修改均……

筛选用于增强OSH生产的关鍵酶HST

高丝氨酸琥珀酰转移酶（HST，由基因metA编码）是OSH生物合成途径中的限速酶，它催化L-高丝氨酸和琥珀酰-CoA转化为OSH。该酶的表达和活性受到转录抑制剂MetJ的严格调控，同时也受到其终产物（包括L-甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸）的反馈抑制（Sagong等人，2022年；Chen等人，2023年）。解除关键酶的反馈抑制……

结论

从实验室保存的大肠杆菌 W3110出发，通过系统的代谢工程策略构建了一种高产OSH的菌株OSHM40，包括抑制竞争性途径、增强前体供应、平衡关键代谢途径、改善辅因子再生和优化能量代谢。经过上述改良后，摇瓶发酵中的OSH滴度从7.82 ± 0.09 g/L提高到了20.15 ± 0.21 g/L

CRediT作者贡献声明

何素月：可视化、验证、研究。黄思敏：写作 – 原初稿撰写、可视化、验证、方法学、研究、数据分析。谭乐天：验证、研究、数据分析。王若楠：验证、研究、数据分析。刘志强：写作 – 审稿与编辑、监督、方法学。牛坤：写作 – 审稿与编辑、监督、方法学。郑玉国：监督、资源管理、项目申请。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（22578411）和京津冀区域环境综合治理-国家重点科技专项（2026ZD1218800）的支持。

Si-min Huang|Xu-yue He|Ruo-nan Wang|Le-tian Tan|Kun Niu|Zhi-qiang Liu|Yu-guo Zheng