使用快速全面二维液相色谱 - 高分辨质谱进行非目标筛查 II：Mosaic 工作流——为 LC×LC-HRMS 开发可扩展且开源的非目标筛查数据处理工作流及其在废水排放物中的应用

《Journal of Chromatography A》：Non-target screening using fast comprehensive two-dimensional liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry II: The Mosaic workflow - Development of a scalable and open-source non-target screening data processing workflow for LC×LC-HRMS and its application to wastewater effluent

　　

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  Mosaic 工作流程实现了针对 LC × LC-HRMS 数据集的可扩展非靶向筛查。
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  结合 MF+NMF 实现了 >99% 的检测和成分化准确率。
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  自动化峰体积提取与手动积分性能相匹配 (p = 0.99)。
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  基于相关性的质量过滤提高了复杂样本中的光谱纯度。

引言

LC × LC-HRMS 主要被用作对选定复杂样本进行深入表征的工具 [[1], [2], [3], [4]]。在这些应用中，LC × LC-HRMS 通过增加峰容量、实现分组类型分离和产生更清洁的质谱图，提供更高质量的数据，从而更好地解决样本内的化学多样性 [[4], [5], [6], [7], [8]]。这对于复杂样本的非靶向筛查 (NTS) 尤为有益，其中化合物数量众多且身份往往未知 [9,10]。尽管具有这种潜力，NTS 工作流程很少采用 LC × LC-HRMS。研究人员通常将这种有限的采用归因于缺乏合适的数据处理工作流程以及对长样品序列稳定性的担忧 [11,12]。然而，多项研究已证明 LC × LC-HRMS 可重复运行并在长期分析序列中保持稳定 [7,13,14]。

大多数 LC × LC 研究集中在仪器改进 [11,15]、系统理解 [[16], [17], [18]] 和方法开发 [[19], [20], [21]] 上。目前，开源数据处理工作流程的有限可用性构成了基于 LC × LC-HRMS 数据的 NTS 研究的主要瓶颈。尽管有商业软件可用，但其底层算法未公开披露，这限制了对工作流程性能的了解，并阻碍了修改或扩展。

为解决这种专业软件的缺乏，近期研究提出了各种策略，例如在展开的 (¹t_R × ²t_R) 色谱图上进行一维特征检测，随后进行“解调”步骤 [2,4,22] 以沿第一维 (¹D) 对第二维 (²D) 峰进行分组，或使用曲线分辨技术 [12,23]。然而，“解调”方法假设在后续调制中 ²D 保留时间 (²t_R) 保持不变，这对于全分馏梯度成立，但对于平移或平行的第二维梯度 [24] 则不一定成立，在这些情况下，由于在后续调制中给定的 ²t_R 处 ²D 达到了更高的洗脱强度，峰可能会对角线移动。因此，在后续调制中，²D 峰可能会落在“解调”窗口之外。

多元曲线分辨 (MCR) 对两个维度中保留时间的稳定性限制较少，因此被建议作为解调策略的替代方案。然而，近期研究表明，诸如 MCR 的曲线分辨模型在分辨低强度峰时存在困难 [[25], [26], [27]]，并且一种包括基于洗脱曲线余弦相似度的质量过滤 (MF) 步骤的嫌疑筛查工作流程在低强度峰方面优于 MCR [26]。通过丢弃与每个特定色谱峰无相关的质量通道，这种方法显著增加了每个色谱峰的信噪比，允许 MCR 分辨原本会被背景方差掩盖的低强度峰。不幸的是，以其目前的形式，这种预过滤方法不适用于 NTS，因为它需要一个嫌疑清单，其中每个嫌疑化合物有一个质荷比 (m/z)，例如质子化离子。

本研究的主要目标是开发、实施和应用一种用于来自较多样本集的综合 LC × LC-HRMS 数据的 NTS 信号处理工作流程。该工作流程旨在可靠地提取峰体积，并通过成分化样本内和样本间相关的 m/z 信号——包括加合物、同位素和源内碎片——来获得痕量化合物的高质量质谱图。为实现这一目标，我们通过移除对预定义参考洗脱曲线的依赖并在所有样本中同时应用非负矩阵分解 (NMF) 以进一步分辨混合成分，将 [26] 中提出的质量过滤 (MF) 框架扩展至 NTS 应用。为了提高可扩展性，该工作流程实现了磁盘存储以减少内存占用，并使用高效的 NMF 算法执行 MCR 步骤。该工作流程以数据的视觉美感命名为 Mosaic。

我们在一个污水处理厂 (WWTP) 出水样本数据集上验证了 Mosaic 工作流程，该数据集使用了 14 种加标到现场空白、质量控制 (QC) 和实际样本中的内标 (IS)。为此，使用 Mosaic 和主成分分析 (PCA) 调查了从丹麦六个 WWTP 收集的 43 个环境样本化学指纹图谱（即化合物模式）的差异。使用在数据非依赖性采集 (DIA) 模式下获取的前体离子和碎片质谱，以及从分组类型分离中推导出的信息，对区分 WWTP 的化合物进行暂定鉴定。

章节片段

采样和样品制备

废水样本于 2022 年 10 月 27 日至 2023 年 2 月 22 日期间从丹麦六个 WWTP 以及位于奥登塞 NV WWTP 上游的两个点源（标记为源 A 和 B）采集。废水出水作为 24 小时流量比例混合样本采集。用甲酸和氢氧化铵将 pH 值调节至 6.5，然后使用孔径为 1.6 μm 和 0.7 μm 的玻璃纤维滤膜对样品进行过滤。样品随后被富集至相对

Mosaic 工作流程的验证：IS 的检测率

使用结合 MF+NMF 的工作流程，在所有 75 个样本中检测到十种 IS，三种 (MEL, CAF, VEN) 在 75 个样本中的 74 个中被检测到，一种 (MTF) 在 75 个样本中的 66 个中被检测到 (图 2)。对于所有检测到的化合物，[M+H]⁺ 离子是成分质谱中的基峰离子，除了 TRI，其 [M+Na]⁺ 是基峰离子。如图 2 所示，Mosaic 工作流程对所有 14 种 IS 实现了 98.9% 的检测真阳性率 (TPR) 和 100% 的成分化。对于具有高斯峰形的 IS (n = 13)，检测

结论

本研究证明，使用 LC × LC-HRMS 进行定量、可扩展的 NTS 需要两步成分化策略。在 75 次进样中，只有结合 MF+NMF 的工作流程实现了高检测灵敏度 (TPR 99%) 以及正确的跨样本成分化 (100%)。核心方法论结论是，基于相似性的质量过滤和跨样本曲线分辨是互补的，并且在 LC × LC-HRMS 中可靠检测和成分化需要两者共同存在

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能似乎影响了本报告工作的结果。

生成式人工智能的使用

在准备本工作期间，作者使用了 Copilot (Microsoft) 和 ChatGPT (OpenAI) 以改进语言和可读性以及优化代码。使用此工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容承担全部责任。

CRediT 声明

Oskar Munk Kronik: 概念化，写作 – 初稿，写作 – 审查与编辑，方法学，形式分析，可视化。 Ryland T. Giebelhaus: 写作 – 审查与编辑，方法学 Selina Tisler: 写作 – 审查与编辑，方法学 Jan H. Christensen: 概念化，写作 – 审查与编辑，监督，方法学，资金获取。 Giorgio Tomasi: 概念化，写作 – 审查与编辑，监督，方法学，资金获取。 Nikoline Juul Nielsen:

资金来源

该工作由丹麦创新基金项目 VANDALF，资助编号：9067-00032A，化学和毒理学指纹图谱基础设施，资助编号：NNF22OC0075387 资助。

CRediT 作者贡献声明

Oskar Munk Kronik: 写作 – 初稿，可视化，验证，方法学，调查，形式分析，概念化。 Ryland T. Giebelhaus: 写作 – 审查与编辑，方法学。 Jan H. Christensen: 写作 – 审查与编辑，监督，方法学，资金获取，概念化。 Selina Tisler: 写作 – 审查与编辑，方法学。 Giorgio Tomasi: 写作 – 审查与编辑，监督，方法学，资金获取，概念化。 Nikoline Juul

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能似乎影响了本报告工作的结果。

致谢

作者谨向 Mathias B. J?rgensen 和 Austeja Luckute 致谢，感谢他们进行样品采集和制备。研究基础设施由诺和诺德基金会 (资助 NNF22OC0075387) 支持，用于项目“化学和毒理学指纹图谱基础设施 (污染物组学)。这项研究得到了 VANDALF – 链接化学和毒理学指纹图谱以优先在水中进行污染物监测和监管 (丹麦创新基金，项目编号支持

Oskar Munk Kronik|Ryland T. Giebelhaus|Jan H. Christensen|Selina Tisler|Giorgio Tomasi|Nikoline Juul Nielsen