生物炭支持的铜钴硫尖晶石（Co?CuS?）纳米酶用于高效、双模式的比色法汗液感应技术

《Journal of Colloid and Interface Science》：Biochar-supported copper cobalt thiospinel (Co 2CuS 4) nanozymes for atom-efficient, dual-modal colorimetric sweat sensing

　　

摘要

纳米zyme在即时诊断方面具有巨大潜力；然而，其临床应用常常受到高催化活性与生物安全性之间内在矛盾的阻碍，这体现在低原子利用率以及高局部剂量下的不可避免的细胞毒性上。本文报道了一种用Co₂CuS₄纳米晶体（Co₂CuS₄@BH）修饰的石墨化松花粉生物炭，该材料调和了这些相互冲突的需求。通过利用生物炭的导电石墨化基质，我们实现了协同增效，使每个金属原子的比活性提高了60%以上。这种复合纳米zyme在广泛的生理环境中表现出出色的催化稳定性。关键的是，这种结构设计同时减轻了细胞毒性（24小时后的细胞存活率>85%）和溶血现象（<2%），这一效果归因于Co₂CuS₄晶体在生物炭表面的分散，从而减少了局部金属负载，限制了细胞与纳米zyme之间的接触面积。将Co₂CuS₄@BH与葡萄糖氧化酶（一种荧光pH指示剂）和丝素-F127水凝胶结合，制备出了一个不受背景干扰的双模比色传感器。利用34个工程特征和XGBoost算法，该系统分别以90.5%和89.2%的准确率预测了葡萄糖浓度和汗液pH值，实现了糖尿病风险的实时分层（低风险、中等风险、高风险、极高风险）。这项工作表明，生物炭支持的尖晶石纳米zyme可以缓解催化活性与生物相容性之间的传统矛盾，为可穿戴早期预警诊断设备开辟了一条新途径。

引言

天然酶，如葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP），在温和的生理条件下表现出显著的特异性和效率[1]。它们加速生化反应的能力在生物传感和治疗中不可或缺。然而，这些生物分子的广泛应用受到了其固有的脆弱性、易变性和蛋白水解性以及高生产成本的严重限制[2]。这些局限促使了纳米zyme的出现，这类无机纳米材料能够模拟酶的功能，提供更高的稳定性和更低的成本。自2007年发现Fe₃O₄纳米颗粒具有类似过氧化物酶的活性以来，已经研究了一系列过渡金属氧化物、硫化物和碳基材料[3]。其中，过渡金属硫尖晶石（例如Co₃S₄、NiCo₂S₄）受到了特别关注。与氧化物相比，金属-硫键的更强共价性和更好的内在导电性协同增强了它们的混合价态和可调带结构，从而促进了类似的Fenton反应，生成羟基自由基（·OH）[4]，进而氧化显色底物以实现信号放大（例如，从葡萄糖到H₂O₂再到·OH，随后进行显色氧化）[5]。

尽管取得了这些进展，该领域仍然受到一个根本性瓶颈的制约：“活性与毒性”之间的权衡。大多数纳米zyme存在低原子利用率的问题，因为只有表面原子参与催化反应，而内部的大量原子则处于催化惰性状态。这种低效率往往迫使研究人员使用高剂量的纳米材料来获得可检测的信号，从而无意中加剧了潜在的细胞毒性[6]、[7]。虽然单原子催化剂（SACs）通过最大化原子利用率提供了理论上的解决方案，如最近在单原子纳米zyme的配位环境工程方面的进展所示[8]，但它们的合成通常非常复杂，且所得结构不稳定[9]。因此，迫切需要一种能够增强内在活性的可扩展策略[10]。同时，纳米zyme参与的多酶级联反应也展示了在无需复杂酶工程的情况下构建多功能生物分析的潜力，强调了基于纳米zyme的平台在分析应用中的更广泛潜力[11]。此外，催化活性必须足够高以确保灵敏度，同时又要受到限制，以避免产生过多的活性氧（ROS），从而保障生物安全性[12]。

在本研究中，我们构建了一种铜钴硫尖晶石（Co₂CuS₄），以加速H₂O₂的分解，促进·OH的生成，并利用Co²⁺/Co³⁺和Cu⁺/Cu²⁺之间的协同氧化还原循环。此外，Co₂CuS₄纳米颗粒被固定在石墨化松花粉生物炭上，以克服块状晶体固有的低原子利用率问题。这种生物炭源自可再生的松花粉（Pinus属植物），是一种农业和林业废弃物，经济价值较低，但它具有三维多孔结构、高导电性以及丰富的纳米晶体固定位点[13]。与其他生物相容性支撑材料（如氧化石墨烯、介孔二氧化硅或合成聚合物）相比，天然来源的生物炭具有成本极低、易于扩展以及由于碳质非免疫原性表面而具有内在的生物相容性等优点[14]。基于上述讨论，我们假设生物炭支撑将（i）提供丰富的成核位点，空间限制Co₂CuS₄的原位生长，防止大规模聚集；（ii）由于位点密度较高，减少所需的晶体负载，从而减少金属离子的释放，提高生物相容性。我们将这种毒性缓解机制称为“空间隔离介导的生物安全性”。

整体设计遵循图1所示的工作流程。Co₂CuS₄纳米晶体通过水热法合成，并通过中心复合设计（CCD）筛选优化了其催化活性，确认其在模拟体液环境中的可靠性能（图1A）。生物炭支撑物通过碳化原始松花粉（一种低成本的农业废弃物）获得，然后通过第二次水热步骤用Co₂CuS₄进行修饰（图1B）。丝素微球通过乙醇诱导的自组装方法制备（图1C）。这些组件与F127、显色指示剂（4-氨基安替比林、4-AAP和荧光素异硫氰酸酯FITC）和GOx混合，形成了最终的比色传感器水凝胶，该水凝胶具有三个关键特性：高位点利用率（由于生物炭诱导的分散）、优异的生物相容性（通过细胞和溶血实验验证）以及光学稳定性（不受背景影响）。图像采集后，提取了34个工程特征，并使用XGBoost模型和嵌套交叉验证来预测葡萄糖浓度和pH值，随后转换为四级风险分类（图1D）。机器学习模块解决了环境敏感的比色读数的固有挑战，实现了无需外部校准的稳健预测。从高效纳米zyme设计、统计优化到机器学习增强读数的整个系统表明，生物炭支持的Co₂CuS₄纳米晶体可以同时实现高催化位点效率、优异的生物相容性和实用的诊断功能。这项工作为下一代可穿戴传感器提供了一种可扩展且通用的策略，其中纳米zyme支撑与活性金属中心本身同样重要。

章节片段

试剂和材料

硝酸铜(II)三水合物（Cu(NO₃)₂·3H₂O，≥99.9%），硝酸钴(II)六水合物（Co(NO₃)₂·6H₂O，≥99.9%），硫乙酰胺（C₂H₅NS，≥98%），尿素（≥99.5%），过氧化氢（30 wt%），4-氨基安替比林（4-AAP），o-苯二胺（OPD），2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）和荧光素异硫氰酸酯（FITC）均购自Sigma-Aldrich。Pluronic F127（Mw = 12,600）购自Aladdin。除非另有说明，所有试剂均按

Co₂CuS₄的结构和电子特性

合成的Co₂CuS₄纳米晶体通过扫描电子显微镜（SEM/TEM）和透射电子显微镜（TEM）进行了表征，观察到平均直径约为505 nm的聚集体纳米颗粒（图1A和B，图S1）。能量色散X射线光谱（EDS）图谱确认了Co、Cu和S的均匀分布（图1C）。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）解析的晶格条纹对应于尖晶石结构的（220）、（422）、（311）和（440）平面，这一点得到了

结论

总之，我们开发了一种用Co₂CuS₄纳米晶体修饰的石墨化松花粉生物炭（Co₂CuS₄@BH），克服了基于纳米zyme的诊断方法的两大长期限制：低原子效率和生物相容性不足。与原始Co₂CuS₄相比，这种生物炭支撑使每个金属原子的比活性提高了60%以上。这种增强效果源于两个协同效应：（i）生物炭提供了丰富的成核位点，空间限制了Co₂

CRediT作者贡献声明

夏立东：撰写——原稿，研究。冯晓：研究。张向龙：验证。张瑞：方法学，数据管理。李仲明：撰写——审稿和编辑，监督。

资助

本工作得到了中国国家自然科学基金（批准号：52563022）、云南基础研究项目（批准号：202401BE070001-036和202501 AU070136）以及

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（批准号：52563022）、云南基础研究项目（批准号：202401BE070001-036和202501 AU070136）的财政支持，以及

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