(Z)-2-氰基-4-氧代-3,4-二苯基丁-2-烯酸乙酯：一种用于食品样品中香兰素选择性检测的新型荧光探针

《Journal of Food Composition and Analysis》：Ethyl (Z)-2-cyano-4-oxo-3,4-diphenylbut-2-enoate: A novel fluorescent probe for selective detection of vanillin in food samples

　　

香兰素广泛应用于食品和工业领域，但过量摄入可能带来健康风险。因此，开发高灵敏度和高选择性的新型检测策略对于准确识别香兰素至关重要。通过以氰乙酸乙酯、联苯酰和氨水为原料的消除反应，合成了一种新型荧光探针(Z)-2-氰基-4-氧代-3,4-二苯基丁-2-烯酸乙酯(ECOD)。该探针的最大荧光激发和发射波长分别为300 nm和340 nm，量子产率为22.6%。研究发现ECOD对香兰素检测具有高选择性和高灵敏度，这归因于ECOD与香兰素结合后诱导构象变化并触发分子间电荷转移(ICT)，最终导致荧光猝灭。因此，建立了一种基于荧光的方法用于定量饼干、糖果和奶酱中的香兰素，线性检测范围为1.0至100 μM，检出限为0.33 μM，回收率范围为93.2%至113%，相对标准偏差(RSD)范围为2.8%至10%。这些结果表明ECOD在食品分析中具有显著的应用潜力，提示基于ECOD的荧光方法可为复杂食品基质中香兰素的快速测定提供一种新途径。

香兰素（vanillin）是食品中广泛使用的增香剂，过量摄入可能引起过敏、偏头痛等健康问题，因此开发高灵敏、高选择性的检测方法至关重要。现有检测方法包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、电化学、毛细管电泳、化学发光、表面增强拉曼散射(SERS)和荧光法等。其中荧光法因操作简单、灵敏度高、响应快等优势备受关注，但已有荧光探针往往结构不明确或特异性不足。为此，研究人员设计并合成了一种新型荧光探针(Z)-2-氰基-4-氧代-3,4-二苯基丁-2-烯酸乙酯(ECOD)，用于食品样品中香兰素的选择性检测。该研究发表于《Journal of Food Composition and Analysis》。

研究人员以氰乙酸乙酯、联苯酰和氨水为原料，通过消除反应合成ECOD，并进行了结构表征和光学性质研究，建立了基于ECOD的香兰素荧光检测方法，将其应用于实际样品分析，并结合理论计算揭示了荧光猝灭机理。结果表明，ECOD对香兰素表现出高选择性和高灵敏度，在复杂食品基质中具有良好应用潜力。

主要技术方法包括：一锅法合成ECOD；使用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、质谱(MS)和核磁共振氢谱(1H NMR)进行结构表征；采用紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱、三维荧光光谱和相对量子产率法（以硫酸奎宁为参比）评估光学性质；通过荧光滴定和选择性实验（干扰物包括Cr3?、Pb2?、Ba2?、Na?、Fe3?、Mn2?、Mg2?、Zn2?、Ag?及钼酸、柠檬酸、硫脲、葡萄糖）测定响应性能；实际样品为本地超市购买的两种饼干、糖果和奶酱，经甲醇-水提取、超声、离心、过滤和硅胶柱净化后，分别用荧光法和高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)测定香兰素含量；利用密度泛函理论(DFT)（Gaussian 16，M06-2X/def2-SVP优化基态，PBE0/def2-SVP计算激发态，SMD溶剂化模型）和Multiwfn空穴-电子分析探究猝灭机理。

### 3.1 探针ECOD的合成机制

ECOD的合成经历了亲核加成和消除两步。在碱性条件下，氰乙酸乙酯的α-碳失去质子形成α-氰基碳负离子，该碳负离子进攻联苯酰的羰基碳，生成烷氧负离子中间体，经质子化后得到β-羟基-α-氰基酯；随后在碱性条件下羟基去质子化形成烷氧负离子，通过消除反应脱去水分子，最终得到目标产物ECOD。

### 3.2 探针ECOD的结构表征

FT-IR谱图显示，3069 cm?1处为芳香C–H伸缩振动峰，2236 cm?1处为氰基(–C≡N)伸缩振动峰，1720 cm?1和1662 cm?1处分别为酯羰基(C=O)和共轭烯酮羰基的伸缩振动峰，1593–1450 cm?1范围内的多重峰归属于芳环骨架的C=C伸缩振动，1371 cm?1处为乙基中甲基(–CH?)的对称变形振动峰。MS谱图给出分子离子峰m/z 305.11（对应分子式C??H??NO?），碎片峰m/z 260.07为失去乙氧基(–OC?H?)所产生。1H NMR谱图中的化学位移和积分比例与预期结构一致，确证了ECOD的成功合成。

### 3.3 探针ECOD的光学性质

三维荧光光谱显示，ECOD在260–325 nm范围内具有宽激发带，对应的发射峰位于300–400 nm，最佳激发波长为300 nm，最大发射波长为340 nm，斯托克斯位移约40 nm。UV-Vis吸收光谱在200–340 nm范围内出现多个特征峰，归属于π→π*和n→π*跃迁。以硫酸奎宁为参比，采用相对量子产率法测得ECOD的荧光量子产率为22.6%，表明该探针具备构建高灵敏荧光检测方法的潜力。

### 3.4 选择性与香兰素测定

选择性实验结果表明，加入常见金属离子（Cr3?、Pb2?、Ba2?、Na?、Fe3?、Mn2?、Mg2?、Zn2?、Ag?）和食品常见小分子（钼酸、柠檬酸、硫脲、葡萄糖）时，探针的F?/F比值均接近1.0，而加入香兰素后F?/F比值增至约8.5，说明ECOD对香兰素具有优异的选择性。荧光滴定实验显示，随着香兰素浓度从1.00 μM增至100.00 μM，荧光强度逐渐猝灭，线性方程为F?/F = 0.0652C + 1.0029，R2 = 0.997，检出限低至0.33 μM。与已报道的香兰素检测方法相比，ECOD为结构明确的纯有机小分子，不含重金属，合成简便且成本低，适用于常规食品分析。

### 3.5 复杂基质中香兰素的定量

将建立的荧光方法应用于实际样品测定，饼干预处理样品1、饼干预处理样品2和糖果中香兰素含量分别为3.10、6.55和21.5 μg/g，奶酱中未检出香兰素。加标回收率范围为93.2%至113%，RSD均小于10%。HPLC-DAD验证结果与荧光法测定值高度一致，证明该方法准确可靠。

### 3.6 香兰素诱导荧光猝灭机理

DFT理论计算显示，ECOD单体呈现近平面的高度共轭构象。加入香兰素后，两者通过氢键形成复合物，导致探针骨架发生扭曲，共轭平面被破坏。空穴-电子分析表明，孤立ECOD的S?态电子和空穴高度重叠，振子强度为0.235，表现为局部激发(LE)特性；而ECOD/香兰素复合物中电子与空穴明显分离，振子强度骤降至0.0156，呈现典型的电荷转移(CT)态，该“暗态”有效打开了非辐射衰减通道，加速激发态能量耗散，最终导致荧光猝灭。

### 讨论与结论

该研究构建的ECOD荧光传感平台具有灵敏度高、线性范围宽、操作简便等优势，在复杂食品基质中可快速准确地测定香兰素含量。其明确的分子结构和无重金属组成弥补了现有部分荧光探针的不足。结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员设计并合成了一种新型有机荧光探针(Z)-2-氰基-4-氧代-3,4-二苯基丁-2-烯酸乙酯(ECOD)。该探针因其扩展的π共轭骨架而表现出优异的荧光性能，量子产率高达22.6%。值得注意的是，该探针对香兰素表现出良好的选择性和灵敏度，可在1.00–100.00 μM范围内定量香兰素，检出限低至0.33 μM（0.05 μg mL^-1）。所提出的机理是探针与香兰素结合引起构象扭曲，触发电荷转移并导致荧光猝灭。基于此，构建了一种适用于饼干、糖果和奶焦糖酱等实际样品中香兰素含量测定的高灵敏检测平台。总之，(Z)-2-氰基-4-氧代-3,4-二苯基丁-2-烯酸乙酯荧光探针为食品中香兰素的快速准确检测提供了新思路。