甜茶多糖经肠肝轴缓解溃疡性结肠炎小鼠的炎症并调控肠道稳态

《Journal of Functional Foods》：Sweet tea polysaccharides alleviate inflammation and regulate intestinal homeostasis via the gut-liver axis in ulcerative colitis mice

　　

摘要

甜茶（Rubus suavissimus S. Lee）是一种天然植物，具有低热量、高甜度和促进健康的特性，其主要的活性成分为多糖。甜茶多糖（sweet tea polysaccharides，STP）被鉴定为一种酸性杂多糖，在体外实验中通过降低脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的RAW264.7细胞中一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的分泌，并增加白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的分泌，表现出优异的抗炎潜力。本研究旨在探讨STP对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）小鼠的保护作用及其潜在机制。结果表明，STP改善了UC小鼠的临床症状，包括体重减轻、疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分和病理损伤。此外，STP通过肠肝轴双向调节结肠和肝脏中关键炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-10）的分泌。同时，STP增强了结肠上皮紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-3和Occludin）的表达，从而修复受损的肠道屏障并减少内毒素易位。16S rRNA测序分析显示，STP干预提高了肠道菌群多样性，增加了有益菌的丰度，并抑制了致病菌的生长。这种微生物群结构的重塑导致了短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）产量的增加，进一步有助于维持肠道微环境稳态和免疫调节。研究结果阐明了STP通过肠肝轴发挥抗炎作用和调节肠道微生态的协同作用，为基于天然产物的UC干预策略提供了新的见解，并突显了其作为功能性食品或治疗制剂的广阔应用前景。

论文解读：甜茶多糖经肠肝轴缓解溃疡性结肠炎小鼠炎症并调控肠道稳态的机制研究

一、研究背景与目的

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见的炎症性肠病，全球患病率估计约500万例，且发病率逐年上升，以黏液性或非黏液性血性腹泻为特征。UC呈进行性发展，可导致肠道出血、梗阻、穿孔及结直肠癌风险增加等严重并发症。肠道屏障功能障碍是UC的主要驱动因素，屏障损伤促进病原体入侵，引发炎症细胞浸润及白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症介质过度分泌。肠道菌群失调亦与炎症性肠病的发生发展密切相关，UC患者表现为微生物多样性降低、有益共生菌耗竭和促炎菌群富集。此外，肠道菌群失调破坏肠道屏障完整性，促使脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等微生物产物易位进入门脉循环，进而激活肝脏TLR4/MyD88/NF-κB信号通路并触发肝脏炎症。肠肝轴构成一个高度整合的系统，通过门静脉和胆汁酸肠肝循环在解剖学上连接肠道与肝脏，介导二者之间的双向通讯。目前UC的治疗药物主要包括氨基水杨酸类、皮质类固醇、免疫抑制剂和生物制剂，这些药物旨在减轻炎症，但未能显著修复肠道屏障或改善肠道菌群，且存在肝肾毒性、药物依赖和停药后复发等风险。因此，迫切需要开发能够提供抗炎作用、修复肠道屏障并改善肠道菌群的新型UC治疗药物。

甜茶（Rubus suavissimus S. Lee）是蔷薇科悬钩子属落叶灌木，原产于中国西南部。甜茶叶富含甜茶苷、多酚、黄酮和多糖等活性物质，具有优异的抗炎活性。甜茶多糖（sweet tea polysaccharides，STP）作为甜茶叶的主要活性成分之一，是由鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和葡萄糖醛酸（Glc-UA）组成的酸性杂多糖。本研究在前期对STP-60a进行详细结构表征的基础上，进一步探讨STP治疗UC的疗效和机制，重点阐明其通过肠肝轴调节炎症反应的作用，及其对肠道屏障功能和肠道菌群稳态的影响。

二、主要技术方法

体外抗炎活性评价采用CCK-8法检测STP对RAW264.7细胞增殖活性的影响，并以LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型，通过Griess反应检测NO分泌量，ELISA法检测TNF-α、IL-6和IL-10水平。体内实验以雄性Balb/c小鼠为研究对象，随机分为正常对照组（CON）、模型组（MOD）、STP高剂量组（STP-H，400 mg/kg/day）和STP低剂量组（STP-L，200 mg/kg/day），采用3%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）自由饮水7天诱导UC小鼠模型。通过疾病活动指数（DAI）评分、血常规分析、苏木精-伊红（H&E）染色评估疾病严重程度；采用免疫荧光染色和Western blot检测结肠紧密连接蛋白表达；运用16S rRNA基因测序分析肠道菌群多样性与组成；采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）定量粪便短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）含量。

三、研究结果

（一）STP对RAW264.7细胞增殖活性的影响

CCK-8结果显示，0–400 μg/mL的STP以剂量依赖方式促进RAW264.7细胞增殖，而600 μg/mL和800 μg/mL浓度下细胞增殖率显著降低，表现出毒效应，呈现低剂量刺激、高剂量抑制的双相剂量反应特征。基于筛选结果，选择100、200和400 μg/mL进行后续抗炎活性实验。

（二）STP对RAW264.7细胞NO和细胞因子分泌的影响

LPS显著增加巨噬细胞NO分泌，经100、200和400 μg/mL STP干预后，NO分泌分别降低10.14%、26.12%和54.12%。STP以剂量依赖方式降低LPS刺激的RAW264.7细胞中TNF-α分泌（分别降低33.45%、57.73%和75.95%）和IL-6分泌（分别降低31.95%、49.23%和69.38%），同时增加抗炎因子IL-10分泌（分别增加35.83%、61.67%和94.44%），证实STP在体外具有优良的抗炎活性。

（三）STP对UC小鼠的治疗作用

1. STP对UC小鼠体重和DAI评分的影响

实验结束时，MOD组小鼠体重降低34.35%，而STP-L组和STP-H组体重分别降低21.15%和13.51%，表明STP可减轻DSS诱导的体重下降。MOD组DAI评分为3.62±0.17，STP-L组和STP-H组分别降至2.41±0.12和2.03±0.18，说明STP可改善UC小鼠体重减轻、腹泻和便血等临床症状。

2. STP对UC小鼠脏器指数的影响

MOD组小鼠结肠长度由正常对照组的8.2 cm缩短至6.8 cm并伴有严重出血，STP干预显著延长结肠长度并减轻肠道出血。DSS导致肝脏指数显著降低和脾脏指数显著升高，STP治疗后可改善肝脾脏器指数的异常变化，表明STP可减轻DSS引起的肝脾损伤。

3. STP对UC小鼠结肠和肝脏组织形态学的影响

H&E染色显示，MOD组结肠组织表现出严重的上皮结构破坏、腺体排列不规则、隐窝和杯状细胞丧失及明显炎症浸润。STP治疗后隐窝丢失和炎症浸润减轻，腺体排列显著恢复。肝脏组织学结果显示，DSS导致肝细胞间隙增大、肝索排列不规则和炎症浸润，STP治疗后肝细胞间隙显著缩小，肝索结构恢复有序。

4. STP对UC小鼠血常规的影响

血常规检测显示MOD组小鼠红细胞（RBC）计数升高，白细胞（WBC）和血小板（PLT）数量显著降低，表明UC小鼠存在严重炎症状态。STP治疗后RBC计数显著下降，WBC和PLT计数明显回升，提示STP减轻了UC小鼠的炎症状态并改善了免疫功能。

5. STP对UC小鼠炎症因子的影响

DSS使小鼠结肠和肝脏LPS含量分别增加81.58%和75.94%，高剂量STP分别使结肠和肝脏LPS含量降低53.54%和41.39%。STP-H组结肠和肝脏TNF-α水平分别降低43.31%和39.18%，IL-6含量分别降低51.81%和49.37%，IL-10水平分别增加49.26%和56.64%。结果表明STP减轻了DSS诱导的肠道炎症，改善了肠道屏障功能，并减轻了肝脏炎症损伤。

6. STP对UC小鼠肠道屏障的影响

免疫荧光染色和Western blot分析显示，DSS显著降低结肠上皮ZO-1、Claudin-3和Occludin的表达。MOD组中ZO-1、Claudin-3和Occludin蛋白表达水平分别为CON组的48.16%、60.95%和28.80%，高剂量STP干预后分别恢复至95.18%、73.14%和85.69%，证实STP可修复受损的肠道上皮并维持肠道屏障结构完整性。

（四）STP对UC小鼠肠道稳态的影响

1. STP对肠道菌群多样性的影响

16S rRNA测序分析显示，DSS诱导使Chao1和Simpson指数显著降低，STP处理后两项指数显著回升，表明STP恢复了肠道菌群的物种丰富度和多样性。主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）显示各组间样本明显聚类且无重叠，STP组分布趋向接近对照组，表明STP具有调节UC小鼠肠道菌群失衡的潜力。

2. STP对肠道菌群组成的影响

门水平分析显示，DSS刺激降低了拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度并增加了厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度，STP处理使菌群结构向正常样状态转变。属水平分析表明，DSS诱导增加了与肠道黏膜损伤和UC进展相关的瘤胃球菌属（Ruminococcus）、螺杆菌属（Mucispirillum）和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）的相对丰度。STP处理后，拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属（Lactobacillus）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、帕拉普雷沃菌属（Paraprevotella）和普雷沃菌属（Prevotella）等有益菌属相对丰度显著增加。线性判别分析效应大小（LEfSe）分析进一步验证了STP组以有益菌属为优势菌群。

3. STP对UC小鼠SCFAs含量的影响

GC-MS检测结果显示，DSS处理显著降低粪便中甲酸、丁酸和异戊酸水平，STP干预后甲酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸水平均显著升高，总SCFA含量增加，表明STP可增加肠道SCFA产生，调节肠道pH，维持肠道稳态。

4. 肠道菌群与细胞因子的相关性分析

Pearson相关性分析显示，STP富集的菌属包括普雷沃菌属、拟杆菌属、副拟杆菌属和乳杆菌属与抗炎细胞因子和SCFAs呈正相关，而瘤胃球菌属和螺杆菌属与促炎细胞因子呈正相关。脱硫弧菌属与肝脏LPS水平和促炎细胞因子呈正相关，提示肠道菌群失调通过破坏肠道屏障完整性和增加LPS易位促进肝脏炎症。

5. 微生物潜在代谢通路预测

京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库比对预测显示，肠道微生物组的调控通路主要包括生物合成、降解/同化、抗性、能量代谢、糖蛋白通路、大分子修饰和代谢簇，其中生物合成和降解/同化通路最为丰富。生物合成代谢通路主要富集于氨基酸生物合成、脂肪酸和脂质生物合成及碳水化合物生物合成。MOD组在氨基酸代谢、次生代谢物生物合成、碳水化合物和能量代谢等预测代谢通路上显著下降，STP干预后部分通路恢复。

四、研究结论

本研究通过建立LPS诱导的炎症细胞模型和DSS诱导的UC小鼠模型，从体外和体内两个层面探讨了STP的抗炎作用。体外实验证实STP能显著抑制NO、TNF-α和IL-6分泌并增加IL-10水平。动物实验表明STP可改善UC小鼠的体重减轻、DAI评分升高和病理损伤；通过上调紧密连接蛋白表达增强肠道屏障功能；通过促进拟杆菌属、乳杆菌属和帕拉普雷沃菌属等有益菌生长重塑肠道微环境，进而增强SCFAs产生。这些肠道水平的改善通过肠肝轴调节全身和肝脏炎症，营造有利的抗炎环境。研究揭示了STP通过协同调控肠道稳态和肝脏反应来缓解UC的作用机制，为UC治疗机制提供了新的见解，并确定了STP作为UC预防和治疗的有前景的天然候选物。研究也存在一定局限性，如未设置阳性药物对照组、未分析血清细胞因子水平，以及未直接获得支持肠肝轴机制的证据，未来研究应补充阳性对照、血清炎症标志物检测、门静脉LPS水平及粪便菌群移植实验等。