《Journal of Functional Foods》：Hesperidin from citrus peel ameliorates osteoporosis by suppressing FGF23 via the PI3K/AKT/FOXO1 pathway
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摘要
作为一种主要的柑橘类黄酮，橙皮苷（hesperidin, HP）显示出骨保护潜力，但其在钙磷稳态和抗氧化机制中的作用仍不清楚。本研究在维甲酸（retinoic acid, RA）诱导的骨质疏松小鼠和原代骨髓间充质干细胞（bone marrow mese
摘要
作为一种主要的柑橘类黄酮，橙皮苷（hesperidin, HP）显示出骨保护潜力，但其在钙磷稳态和抗氧化机制中的作用仍不清楚。本研究在维甲酸（retinoic acid, RA）诱导的骨质疏松小鼠和原代骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）中研究了HP的抗骨质疏松效应。HP促进了BMSC的增殖、迁移和成骨分化，并增加了碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性和矿化程度。网络药理学分析确定抗氧化PI3K/AKT/FOXO1通路是关键靶点，成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23, FGF23）是核心效应分子。在骨质疏松小鼠中，HP使血清钙、磷和25-羟基维生素D水平正常化，增加了骨形成标志物并降低了骨吸收标志物，减轻了骨量丢失并保留了小梁微结构，同时增强了生物力学性能。在机制上，PI3K/AKT/FOXO1介导的FGF23抑制对于骨保护至关重要，这一点通过使用PI3K抑制剂得到了证实。综上所述，这些发现表明HP通过PI3K/AKT/FOXO1依赖的FGF23抑制恢复钙磷稳态，从而改善RA诱导的骨质疏松，凸显了其作为功能性食品成分的潜力。
橙皮苷（Hesperidin, HP）调控PI3K/AKT/FOXO1-FGF23轴改善骨质疏松的机制研究解读
**研究背景与科学问题**
骨质疏松是一种与增龄相关的慢性代谢性骨病，其核心病理特征表现为骨量进行性丢失、骨微结构退化和骨折风险增加。全球疾病负担研究（Global Burden of Disease, GBD）2021数据显示，2020年全球40岁以上成年人中，低骨密度（low bone mineral density, LBMD）导致约47.7万人死亡和1720万伤残调整生命年（disability-adjusted life years, DALYs），且较1990年分别增加127.1%和89.8%。随着人口老龄化加剧，骨质疏松已成为影响老年人群生活质量的重大公共卫生问题。骨健康与营养摄入密切相关，维持钙磷稳态是骨骼完整性的基础。柑橘类水果作为全球消费量最大的水果之一，其果皮含有丰富的生物活性黄酮类化合物。橙皮苷（hesperidin, HP）是柑橘皮中含量最高的黄酮类成分，已有研究表明其具有抗炎、抗氧化和骨保护特性，但现有研究主要聚焦于其一般抗氧化能力，而关于HP是否通过调控钙磷代谢的关键内分泌因子发挥抗骨质疏松作用，尚缺乏明确的机制学阐释。
成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23, FGF23）是调节矿物质代谢的关键内分泌激素，对血清磷和钙水平具有精确调控作用。已有研究证实，在骨质疏松病理状态下FGF23表达显著升高，抑制骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的成骨分化，加剧骨质疏松的病理进程。FGF23的异常高表达可导致钙磷稳态失衡，进而恶化骨代谢状态。近年来研究表明，FGF23可受氧化应激敏感性信号级联调控，其中包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/叉头框蛋白O1（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/forkhead box O1, PI3K/AKT/FOXO1）通路。基于HP能够调节骨质疏松小鼠钙磷代谢的已有报道，研究人员推测HP可能通过调控FGF23的上游信号通路，抑制其病理性过度分泌，从而纠正钙磷失衡，发挥骨保护作用并拮抗骨质疏松的进展。
**研究主要技术方法**
为验证上述科学假说，研究人员整合了网络药理学预测、体外细胞实验和体内动物实验。体外实验使用原代BMSCs，来源于正常或维甲酸（retinoic acid, RA）诱导的骨质疏松小鼠（品系为SPF级雌性C57BL/6J小鼠）。体内实验采用RA（60 mg/kg）灌胃诱导建立骨质疏松小鼠模型，并设置对照组、模型组、HP低（20 mg/kg）、中（40 mg/kg）、高（80 mg/kg）剂量组及阿仑膦酸钠（alendronate sodium, ALN, 1 mg/kg）阳性对照组。主要技术方法包括：CCK-8细胞活力检测、划痕愈合实验、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色、茜素红S（Alizarin Red S, ARS）染色、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、micro-CT骨微结构分析、三点弯曲生物力学测试、组织病理学染色、免疫组织化学（immunohistochemical, IHC）染色、免疫荧光染色、分子对接以及PI3K特异性抑制剂（LY294002和Wortmannin）通路阻断实验。
**研究结果**
**HP促进骨质疏松小鼠来源的原代BMSCs成骨分化**
研究人员从RA诱导的骨质疏松小鼠中分离培养原代BMSCs，CCK-8实验确认10、20和40 μM浓度的HP在48小时内不影响细胞活力。划痕愈合实验显示，模型组BMSCs的迁移和增殖能力较对照组显著降低，而HP干预有效加速了划痕愈合。ALP和ARS染色结果表明，模型组ALP活性和矿化结节面积均显著减少，HP给药后这些成骨指标得以恢复。进一步的qRT-PCR和Western blot检测显示，模型组中Col1a1、Alp、Runx2、Sp7、Ocn和Opn的mRNA及蛋白表达水平均显著下调，HP干预则上调了这些成骨相关分子的表达，其中高剂量HP效果最为显著。
**抑制FGF23表达经由PI3K/AKT/FOXO1通路可能是HP的潜在作用机制**
研究人员首先采用网络药理学进行靶点预测，共获得HP与骨质疏松的189个交集靶点，并构建了蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络。拓扑分析鉴定出6个核心靶点，其中AKT1和SRC为关键枢纽基因。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示，HP抗骨质疏松靶点显著富集于蛋白酪氨酸激酶活性、转录共激活因子结合等分子功能，以及氧化应激反应、活性氧代谢等生物过程。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析揭示交集靶点主要富集于PI3K-AKT和FOXO信号通路。分子对接实验证实HP与PI3K具有良好的结合亲和力。体外验证实验表明，模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-FOXO1/FOXO1的比值显著降低，而FGF23蛋白表达显著上调；HP干预后通路蛋白磷酸化水平升高，FGF23表达下降。qPCR和ELISA结果一致显示，模型组Fgf23 mRNA表达及细胞培养上清中FGF23分泌水平显著升高，HP干预后显著下调。
**HP减轻骨质疏松小鼠的骨量丢失和微结构退化**
体内实验中，RA诱导的模型组小鼠体重逐渐下降，HP干预后体重显著恢复。骨生物力学和湿重分析显示，模型组最大骨载荷、左股骨重量、股骨重量/体重比值、左胫骨重量及百分比、右后肢重量及百分比均显著降低，HP治疗不同程度改善了这些参数。micro-CT分析显示，模型组骨小梁稀疏断裂，骨髓腔扩大；HP干预明显改善了骨小梁数量和连接性。定量分析结果表明，模型组骨密度（bone mineral density, BMD）、骨体积分数（bone volume fraction, BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number, Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）显著降低，而骨小梁分离度（trabecular separation, Tb.Sp）显著增加；HP治疗显著逆转了这些微结构改变。组织学层面，苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色显示模型组骨小梁明显变薄和丢失，骨髓中脂肪空泡增多，HP治疗后恢复为相对完整的结构。Masson三色染色显示模型组骨形成区域胶原沉积严重减少，HP干预显著增加了胶原合成与沉积。
**HP促进骨质疏松小鼠的骨形成**
血清骨代谢标志物检测显示，模型组骨形成标志物I型前胶原氨基端前肽（procollagen type I N-terminal propeptide, PINP）和骨钙素（osteocalcin, BGP）水平显著降低，骨吸收标志物I型胶原羧基端交联肽（C-terminal telopeptide of type I collagen, CTX-I）和抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRACP-5b）水平显著升高。HP干预后，骨形成标志物显著增加，骨吸收标志物显著降低。骨组织成骨标志物检测显示，模型组成骨相关基因mRNA表达显著下调，HP干预后显著上调，相应蛋白表达变化趋势一致。
**HP激活PI3K/AKT/FOXO1通路抑制FGF23表达并恢复矿物质稳态**
体内骨组织蛋白检测结果与体外一致：模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-FOXO1/FOXO1比值显著降低，FGF23表达显著升高；HP干预后通路蛋白磷酸化水平升高，FGF23表达下调。免疫组织化学结果显示，模型组骨小梁周围FGF23阳性染色面积较对照组显著增加，HP干预后减少。RT-qPCR和ELISA结果证实模型组Fgf23 mRNA和血清蛋白水平显著升高，HP干预后下降。进一步检测血清钙（Ca）、磷（Pi）和25-羟基维生素D [25(OH)D]水平，结果显示模型组血清钙水平轻微下降，血清磷和25(OH)D水平显著降低；HP治疗后这些指标均有不同程度升高，ALN阳性对照组呈现类似趋势。
**抑制PI3K/AKT通路阻断HP介导的FGF23抑制和成骨促进作用**
为验证PI3K/AKT/FOXO1信号轴在HP促进BMSC成骨分化中的必要性，研究人员使用PI3K特异性抑制剂LY294002（10 μM）和Wortmannin（100 nM）进行通路阻断实验。ALP和ARS染色结果显示，与HP单独处理组相比，HP+LY和HP+Wort组的ALP活性和矿化结节面积显著减少，但仍高于抑制剂单独处理组。RT-qPCR检测显示，HP+LY和HP+Wort组成骨分化相关基因表达较HP组显著下调，但高于LY和Wort组，成骨标志蛋白的表达变化一致。Western blot分析显示，与HP组相比，HP+LY和HP+Wort组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-FOXO1/FOXO1比值均降低，FGF23蛋白表达上调。Fgf23 mRNA及细胞培养上清中FGF23含量的变化与细胞内蛋白一致。免疫荧光染色显示，HP+LY和HP+Wort组FOXO1核内荧光信号增强，表明PI3K抑制剂削弱了HP对FOXO1核转位的抑制作用；FGF23荧光强度变化趋势与FOXO1核定位一致。
**讨论与结论**
本研究在RA诱导的骨质疏松小鼠模型和原代BMSCs中系统阐明了HP通过激活PI3K/AKT/FOXO1信号轴抑制FGF23表达、恢复钙磷稳态、促进骨形成的分子机制。研究人员指出，骨质疏松的核心发病机制涉及骨形成-骨吸收平衡破坏与钙磷代谢紊乱的叠加。FGF23作为骨源性激素，其分泌受血清磷和25(OH)D的反馈调节。病理条件下FGF23的过度表达会加剧矿物质流失，形成恶性循环。HP通过抑制FGF23的过度分泌恢复钙磷稳态，为骨矿化创造有利的微环境，从而阻断骨质疏松的病理进展。通路阻断实验证实，PI3K/AKT依赖性FOXO1磷酸化和核排斥是HP下调FGF23和促进BMSC成骨分化的关键机制。
从转化应用角度而言，HP作为柑橘皮中天然丰度较高的黄酮类化合物，具有开发为功能性食品成分或膳食补充剂以维护骨骼健康的潜力。然而，研究人员也指出了研究的局限性：FOXO1与FGF23启动子区之间的精确分子界面需要借助染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）实验进一步阐明；HP的骨保护效力应在绝经后及衰老相关骨质疏松动物模型中进一步验证；FGF23抑制与其他骨源性激素或全身矿物质调节因子之间的潜在相互作用值得更广泛的研究；长期安全评估和精心设计的临床研究对于评价HP作为功能性食品成分的转化价值十分必要。
综上所述，本研究鉴定出PI3K/AKT/FOXO1-FGF23信号轴是介导HP骨保护作用的关键分子通路。研究人员聚焦于FGF23作为钙磷代谢核心调节因子的作用，证实了HP通过PI3K/AKT依赖性FOXO1磷酸化和核排斥抑制其病理性过度分泌。该工作为膳食黄酮类化合物调控骨骼钙磷代谢提供了新视角，揭示了天然黄酮恢复矿物质稳态的潜在通路，加深了对FGF23失调与骨代谢疾病之间交互作用的理解，为开发柑橘皮来源的HP作为维护骨骼健康和钙磷稳态的功能性食品成分奠定了机制基础。
