基于 MnMOF 的双介体重重修饰共固定化漆酶系统：增强染料降解与废水解毒用于水稻秧苗安全种植

《Journal of Hazardous Materials》：A Triple-Modified Co-immobilized Laccase System with Dual Mediators on MnMOF: Enhanced Dye Degradation and Wastewater Detoxification for Safe Rice Seedling Cultivation

　　

摘要

漆酶提供了一种绿色且环保的解决方案，用于降解广泛使用的蒽醌和三苯甲烷染料。然而，其实际应用仍受到几个障碍的限制，包括稳定性差、氧化还原电位低以及中介物泄漏，这影响了染料降解效率和环境安全性。为了应对这些挑战，本研究通过涉及漆酶（LCC5）原位固定在锰基金属有机框架（MnMOF）内、两种氧化还原中介物（ABTS 和对香豆酸（pCA））的共固定化，以及最后用聚乙二醇（PEG）进行表面交联的顺序三重修饰策略，开发了一种新型共固定化漆酶 - 中介物系统（LMS），称为 MnMOF@LCC5@M@PEG。与游离酶相比，MnMOF@LCC5@M@PEG 复合材料表现出 292.03% 的相对活性，热稳定性提高，对有机溶剂和金属离子的耐受性增强，并具有出色的可重复使用性。此外，该复合材料不仅在 15 分钟内实现了对 100 mg/L 茜素红的有效降解，并在 50 小时内对 10 mg/L 结晶紫实现了 68.22% 的降解，而且在各种真实水基质中保持了较高的降解效率，并在连续五次重复使用后保留了超过 70% 的初始活性。此外，构建了一种包含 MnMOF@LCC5@M@PEG 的特定双筛过滤装置，该装置不仅能有效稳定地处理染料废水，而且产生的出水支持正常水稻幼苗生长。因此，我们通过构建三重修饰固定化 LMS 和双筛过滤装置，开发了一个稳健且可回收的生物催化平台，将染料废水解毒至对水稻幼苗种植安全的水平，从而为酶固定化和含染料废水处理提供了一种高性能且可持续的解决方案。

引言

随着全球工业化进程的加速，水污染已成为环境可持续性和公共健康的紧迫威胁 [1]。工业染料废水，特别是来自蒽醌染料（如茜素红，AR）和三苯甲烷染料（如结晶紫，CV）的大量生产和应用，构成了一个主要的污染源，其特征是因其芳香结构而具有高毒性和持久性 [2]。特别令人担忧的是，未经充分处理的废水用于灌溉会通过食物链生物累积引入毒素，对人类健康构成潜在风险。因此，迫切需要高效且经济的修复技术来处理这些顽固染料。如今，几种常规的物理化学方法，如混凝、活性炭吸附、电解、高级氧化、反渗透和臭氧氧化，已被应用于纺织品废水脱色 [2], [3]。然而，高运营成本、能耗和二次废物的产生等挑战通常限制了其经济可行性、环境兼容性和实际可持续性。鉴于这些局限性，基于酶的废水处理作为一种有前景的替代方案引起了极大关注，这得益于其高特异性和温和的操作条件。

漆酶（EC 1.10.3.2）是一种多铜氧化酶，能够利用分子氧催化氧化广泛谱系的有机污染物，同时仅产生水作为副产品 [4], [5]。然而，由于其较低的氧化还原电位（0.4-0.8 V），漆酶只能氧化简单的酚类和其他易氧化化合物。为了将其范围扩大到更顽固的污染物，引入了漆酶 - 中介物系统（LMS），其中氧化还原中介物作为可扩散的电子载体，将降解扩展到非酚类化合物和高氧化还原电位染料 [6]。尽管其性能令人满意，但由于游离漆酶在操作条件下固有的不稳定性、可重复使用性差以及可溶性中介物回收困难，LMS 的大规模应用仍然具有挑战性，这共同增加了处理成本并限制了过程的可持续性 [7]。因此，提高漆酶的操作稳定性和可重复使用性，同时实现中介物的高效回收或循环利用，对于推进 LMS 在染料废水处理中的实际应用至关重要。

酶固定化技术因其能显著增强生物催化剂的操作稳定性和可回收性而被广泛应用。将酶负载到纳米材料上的主要策略包括物理吸附、共价结合、交联和包裹。物理吸附简单直接，但由于相互作用弱而遭受酶泄漏；共价结合提供强附着，但可能引起构象变化和活性部分丧失；交联增强机械稳定性，但通常通过酶刚性化降低比活性 [8], [9]。相比之下，包裹创造了一个保护性微环境，保留了天然构象，有效最小化泄漏，并在没有共价修饰的情况下保持高催化活性 [10]。金属有机框架（MOFs）最近因其可调节的孔隙率、高比表面积和功能多样性而成为有吸引力的宿主材料。最近的研究表明，MOFs 可以作为漆酶固定化的有效支撑物，显著增强其催化活性和操作稳定性，例如 Cu(PABA)-包裹的漆酶表现出比游离酶高 1.7 倍的活性 [11]。如今，关于共固定化完整漆酶 - 中介物系统（LMS）的研究仍然稀缺，大多数研究集中在单一中介物系统上。例如，一种共固定化漆酶和仅 ABTS 的 MOFs 膜在 30 分钟内仅实现了 20% 的三苯甲烷染料去除率，这归因于中介物通过弱静电相互作用从根本上局限于对 MOFs 的吸附，导致中介物泄漏和活性快速丧失 [12]。此外，双中介物系统尽管有潜力通过协同效应扩展底物范围并增强电子转移，但仍未被探索。鉴于 ABTS 和 pCA 互补的氧化还原电位和合适的分子大小，选择了这种双系统。因此，迫切需要一种将双中介物与固定化漆酶相结合的新策略，以实现超越单一中介物方法的优异操作稳定性、可重复使用性和中介物可回收性。

直接回应游离酶脆弱性、中介物回收困难和染料降解效率差等关键问题，本研究提出了一种先进的分步策略，通过原位漆酶固定化、双中介物吸附和 PEG 表面交联构建 MnMOF@LCC5@M@PEG 共固定化 LMS（方案 1A）。MnMOF@LCC5@M@PEG 允许高效的电子穿梭和氧化还原循环机制，能够氧化像 AR 和 CV 这样的顽固染料。随后，设计了一种包含共固定化 LMS 的分层结构，以实现染料废水的连续稳定流动进行有效脱色，允许将所得滤液安全用于水稻种植（方案 1B）。因此，三重修饰固定化 LMS 的合理设计直接解决了关键局限性，协同提升操作稳定性、可重复使用性和催化效率，最终构建出一种产生对水稻幼苗种植安全废水的特定双筛过滤装置。

章节片段

材料与化学品

四水合氯化锰（MnCl₂?4H₂O, 98%）、2-甲基咪唑（2MI, 97%）、聚乙二醇（PEG, 20,000）、甲醇、乙醇和丙酮，购自 Sigma-Aldrich。金属的氯化物盐（K?, Na?, Li?, Co²?, Zn²?, Ca²?, Ni²?, Mn²?, Pb²⁺, Mg²?, Fe²?, Cr³⁺, Bi³⁺）购自国药集团化学试剂有限公司。愈创木酚、2,2'-联氮 - 双 -（3-乙基苯并噻唑 -6-磺酸酯）（ABTS, 99%）、p-对香豆酸（pCA）、阿魏酸（FA）、香草酸（VA），

MnMOF@LCC5 和 MnMOF@LCC5@M@PEG 的制备与优化

序列分析表明，来自 C. cinerea 的 LCC5 由 533 个氨基酸组成，计算分子质量为 57.4 kDa，理论 pI 为 4.71（表 S1），与含有 60 个带负电荷残基（Asp+Glu）和 29 个带正电荷残基（Arg+Lys）的酸性蛋白质一致（表 S2）。在甲醇诱导下，漆酶 LCC5 在 P. pastoris 中成功表达，通过离子交换色谱纯化，并通过 SDS-PAGE 鉴定，显示了一条蛋白质条带

结论

总之，本研究通过来自 C. cinerea 的漆酶 LCC5 的原位固定、两种氧化还原中介物（ABTS 和 pCA）的共吸附以实现协同电子转移，以及 PEG 交联以防止泄漏的顺序过程，成功构建了三重修饰固定化 LMS（MnMOF@LCC5@M@PEG）。该设计导致在广泛 pH 和溶剂条件下显著增强的催化效率和操作稳定性，以及出色的

CRediT 作者贡献声明

滕一梦： 调查、形式分析、数据整理。秦辉： 数据整理。李全法： 可视化、方法论。舒聪瑞： 可视化。余娇： 写作 – 原稿起草。刘胜龙： 写作 – 原稿起草。方泽民： 监督。王广峰： 写作 – 审查与编辑、概念化。王宝娟： 写作 – 审查与编辑、监督、资助获取。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本报告工作的出现。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金（32571477, 32071270）、安徽省重点科技项目（202523n10050003）、微生物多样性与创新利用国家重点实验室（SKLMMDIU-KF202503）、安徽省高校分子酶学与检测优秀创新团队（2022AH010012）、安徽省高校协同创新计划（GXXT-2022-067）、生物技术

余娇 | 刘胜龙 | 滕一梦 | 秦辉 | 李全法 | 舒聪瑞 | 方泽民 | 王广峰 | 王宝娟

安徽省分子酶学与主要代谢疾病机制重点实验室，安徽省分子检测与诊断工程研究中心，安徽师范大学生命科学学院，安徽芜湖 241002，中国