关于邻苯二甲酸酯逐步降解的结构洞察：二烷基/单烷基邻苯二甲酸酯水解酶与其中间产物及最终产物的共晶结构

《Journal of Hazardous Materials》：Structural Insights into Sequential Phthalic Acid Ester Degradation: Co-Crystal Structures of a Dialkyl/Monoalkyl Phthalate Hydrolase with Intermediate and Product

　　

摘要

邻苯二甲酸酯（PAEs）是一种持久的污染物，对环境和健康构成威胁。二烷基/单烷基PAE水解酶能够完全降解PAEs，显示出可持续的生物修复潜力，但其双重功能机制仍不清楚。本研究解析了EstJ6与催化中间体单丁基邻苯二甲酸（MBP）及其水解产物邻苯二甲酸（PA）的共晶结构，揭示了一种保守的α/β水解酶折叠方式。分子动力学模拟和晶体学B因子比较表明，在底物结合之前，催化核心已大部分预稳定为高效构象，而盖子结构域仍保持动态可塑性。尽管催化三联体（由Ser146、His270和Glu240组成）能够催化二丁基邻苯二甲酸（DBP）水解为MBP，再进一步水解为PA，但第二步效率较低。结构分析显示Ser146与第二个酯键之间的距离过大（6.1–6.4 ?），超出了理想的3–4 ?范围。此外，EstJ6负电荷通道内的静电屏蔽不足进一步影响了MBP的结合稳定性。突变实验表明Trp176对π-π堆叠至关重要，而Leu274则存在空间阻碍。值得注意的是，L274A突变体的活性提高了1.5倍，这表明对通道结构进行工程改造是一种可行的优化策略。这些发现加深了对PAE水解酶在生物修复应用中的机制理解。

引言

邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类广泛用于工业生产的化学物质，主要作为增塑剂添加到塑料制品中，以提高其柔韧性和耐用性[1]。然而，在塑料的生产、使用和处置过程中，PAEs会轻易释放到环境中。由于其化学结构稳定，它们难以自然降解，因此在环境中普遍存在。这些持久性残留物对生态和人类健康构成威胁，亟需开发有效的修复策略[2],[3]。虽然PAE水解酶介导的酶促降解提供了一种可持续的修复方法，但能够依次降解二烷基和单烷基PAEs的双功能水解酶的发现是生物修复研究的重要进展[4]。

与传统需要协同作用才能完成降解过程（例如将二丁基邻苯二甲酸（DBP）先水解为单丁基邻苯二甲酸（MBP），再进一步水解为邻苯二甲酸（PA）的二烷基或单烷基PAE水解酶不同，双功能水解酶可以通过单一酶实体简化这一过程（见补充图S1）[5]。这种独特能力不仅提高了降解效率，还减少了中间产物积累带来的风险（例如，MBP的毒性和流动性均高于其母体化合物[6]）。二烷基/单烷基PAE水解酶的这种独特的催化双重性为阐明其酶促机制带来了机遇与挑战。与单功能酶不同，这些酶能够依次切割DBP中的两个不同化学结构的酯键（二烷基PAEs）及其中间体MBP（单烷基PAEs）[7]。然而，同时水解二烷基和单烷基PAE的精确分子决定因素仍属推测。一个关键的知识空白是缺乏明确的结构证据，说明酶的活性位点如何在顺序水解过程中同时容纳MBP和PA。这种不足从根本上限制了机制理解和基于结构的酶工程改进。

目前的假说提出了两种可能的双重功能机制[8],[9],[10]。第一种假说认为存在一个包含灵活残留物的单一催化口袋，这些残留物会通过构象变化来适应不同的底物。例如，疏水相互作用可能主导DBP的结合，而极性残留物则参与MBP的定位。第二种假说认为在多结构域架构中存在不同的活性位点，DBP通过相邻催化中心之间的空间通道逐步水解。然而，由于缺乏捕捉中间体结合态或产物结合态的高分辨率结构，这两种模型都未得到最终验证。

尽管最初的研究目标是探索二烷基/单烷基PAE水解酶（EstJ6）与底物DBP的结合机制，但意外地成功解析了EstJ6与中间产物MBP及最终产物PA的共晶结构。这一重要发现为阐明二烷基/单烷基PAE水解酶在多步骤催化过程中的具体机制提供了关键的结构证据。

章节摘要

化学物质与试剂

二丁基邻苯二甲酸（DBP，纯度>98.5%）、单丁基邻苯二甲酸（MBP，纯度>98%）和邻苯二甲酸（PA，纯度>99.5%）均购自中国上海的Aladdin Biochemical Technology公司。Ni²⁺-硝基三醋酸（Ni²⁺-NTA）亲和柱和HiLoad 16/600 Superdex 200凝胶过滤柱由美国马萨诸塞州的Cytiva公司提供。美国加利福尼亚州Aliso Viejo的Hampton Research公司提供了十一套结晶试剂盒，包括Crystal Screen 1和2（HR2-130）、Wizard Class 1、2和3等。

EstJ6晶体的结晶与数据收集

为了将酶-底物复合物捕获在催化不活跃但构象真实的状态下，我们将催化酸性氨基酸Glu240突变为谷氨酰胺（E240Q），这种替换在α/β水解酶中是常用的[24],[25],[26]。广泛的结构性验证，包括催化三联体的叠加、电子密度图分析、距离测量和均方根偏差比较，表明该突变仅引起轻微的局部扰动，没有影响酶的催化活性。

结论

EstJ6的催化机制似乎依赖于一个在底物结合之前就已大部分预稳定的高效构象的催化中心，而盖子结构域保持动态可塑性，并在配体结合时部分有序化。这种组合解释了EstJ6如何在大部分预先形成的活性位点内实现顺序水解。底物的电荷屏蔽不足和构象限制阻碍了MBP/PA的稳定结合。

环境影响

邻苯二甲酸酯（PAEs）是持久性的环境污染物，对生态系统和人类健康构成严重风险。尽管二烷基/单烷基PAE水解酶提供了完全降解PAEs的可持续途径，但它们对有毒中间体单丁基邻苯二甲酸的顺序水解的分子基础及其低效率的原因仍不甚明了。本研究解析了二丁基邻苯二甲酸顺序水解过程中的关键结构信息。

资助

本研究得到了广东省海洋大学科研启动基金（360302062403）、国家自然科学基金（32502121）、安徽省自然科学基金（2508085QC081）以及安徽省高校分子酶学与检测杰出创新研究团队的支持（2022AH010012）。

CRediT作者贡献声明

王勇华：验证、方法学研究、数据管理。胡荣康：撰写——审阅与编辑、原始稿撰写、软件应用、资金获取、概念构思。陈叶宝：撰写——审阅与编辑、验证、方法学研究、数据管理。杨刘：验证、方法学研究、数据管理。

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢上海国家蛋白质科学设施（https://cstr.cn/31129.02.NFPS.BL18U1）的BL18U1光束线的工作人员在X射线衍射数据收集与分析方面提供的技术支持。本文的数值计算是在合肥先进计算中心完成的。

陈叶宝|杨刘|王勇华|胡荣康

广东海洋大学食品科学与工程学院，中国阳江市529500