紫外交联磺化透明质酸微球用于可生物降解脑血管镁植入物稳定生物界面的机制研究

《Journal of Magnesium and Alloys》：Mechanistic insights into ultraviolet-crosslinked sulfonated hyaluronic acid microspheres for stable biointerfaces on biodegradable cerebrovascular magnesium implants

　　

缺血性卒中仍然是全球死亡和残疾的主要原因，凸显了开发更安全、更有效的脑血管植入物的迫切需求。可生物降解镁（Mg）合金具有高机械强度和神经保护性Mg²⁺离子等优势，但其快速腐蚀和内皮化延迟限制了其临床应用。研究人员采用微流控技术制备了单分散的磺化透明质酸-酪胺（S-HA-Tyr）微球。随后通过三(2,2′-联吡啶)氯化钌(II)/过硫酸钠（Ru/SPS）介导的紫外（UV）交联对微球进行稳定化处理，形成致密且高度稳定的二酪氨酸网络。将UV固化微球整合到ZE21B镁合金上的多级氟化镁（MgF₂）/聚多巴胺（PDA）/S-HA-Tyr涂层中，同时实现耐腐蚀性、界面强化和血管生物活性。与传统通常仅提供单一功能的镁合金涂层不同，该多级MgF₂/PDA/S-HA-Tyr系统将腐蚀防护、界面粘附和血管生物活性整合于同一平台。该涂层显著降低了腐蚀电流密度（近两个数量级），腐蚀电位正移330 mV，腐蚀速率降低>85%，同时表现出优异的血液相容性，溶血率极低（0.19%）。纳米压痕测试显示弹性模量（18–58 GPa）和硬度（0.9–3.2 GPa）显著增加，蠕变变形减少，表明涂层具有强大的界面强化作用。重要的是，内皮细胞（ECs）和平滑肌细胞（SMCs）的体外共培养研究证明了选择性细胞调控：该涂层增强了EC增殖和迁移（约18%），抑制SMC过度增殖同时诱导收缩表型，并促进巨噬细胞（MA）向抗炎M2表型极化。体内皮下植入实验显示组织反应得到改善。这些结果表明，UV交联S-HA-Tyr@微球提供了一种稳健的多功能表面策略，可同时加速内皮修复和控制镁合金降解，为下一代脑血管植入物提供了有前景的平台。

论文解读

一、研究背景与科学问题

缺血性卒中作为全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，对临床治疗策略的开发提出了迫切需求。尽管药物治疗被广泛采用，但血管内支架植入术提供了更为持久的治疗获益。然而，传统不可降解支架（如不锈钢支架）在永久植入后存在长期风险。可生物降解镁（Mg）合金支架因其适宜的机械支撑能力和生物降解特性被视为潜在替代方案。镁具有维持神经元存活和支持血脑屏障修复的神经保护作用。然而，镁的快速腐蚀和内皮化不足仍然是其临床转化的主要障碍。

前期研究表明，基于磺化透明质酸（S-HA）的纳米颗粒涂层（NP@S-HA）可通过多种途径增强镁合金表面的内皮化。然而，纳米颗粒涂层系统在粒径分布和结构均匀性方面难以控制，这可能影响涂层的重复性、稳定性和生物学功能。纳米颗粒系统的主要缺点之一是缺乏对粒径的控制，这损害了涂层的可重复性和多功能性。这些局限性凸显了对具有更高均匀性和可靠生物学性能的精密设计微/纳米结构的需求。

微流控技术为应对这一挑战提供了有效策略，能够制备具有高度可控尺寸和形态的单分散微球。研究人员使用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控平台制备磺化透明质酸-酪胺（S-HA-Tyr）微球，确保了高均匀性、结构完整性和批次间可重复性，这些是在生物医学植入物上构建稳定生物活性涂层的关键要求。

光交联对于稳定S-HA-Tyr微球和维持其生物活性至关重要。以往研究使用可见光（VIS）固化制备功能微球，可促进内皮细胞增殖、抑制过度SMC增殖并诱导抗炎巨噬细胞极化。然而，VIS固化微球在生理介质中稳定性有限，在磷酸盐缓冲液（PBS）中出现尺寸不均匀和形态变化，这可能影响涂层的均匀性和性能。这些局限性表明可见光照射下产生的交联效率和网络结构可能不足以维持微球在生理环境中的长期稳定性。

为克服这些局限性，研究人员引入紫外（UV）固化作为更有效的交联策略。在UV光（365 nm）照射下，Ru/SPS光引发剂催化酪氨酸自由基的快速生成，促进二酪氨酸键的形成，从而制备出具有优异结构稳定性、均匀尺寸和良好PBS分散性的微球。与VIS固化相比，UV照射能提供更高的光子能量，从而更有效地激活光引发剂体系并加速自由基的产生。与VIS固化微球相比，UV固化微球表现出更高的稳定性、更快的凝胶化速度和更高的交联密度，形成更致密的水凝胶网络，具有更高的机械稳定性。这种增强的网络结构有望改善微球的完整性，防止其在生理介质中变形或聚集，并为在可生物降解镁合金上构建涂层提供更可靠的平台。

Ru/SPS光氧化还原体系是一种高度可控的催化剂，能够精确调节水凝胶微球的交联动力学、网络密度和力学性能。在UV照射下，Ru²⁺吸收光子能量（约365 nm），跃迁至激发态并被氧化为Ru³⁺，随后从酪氨酸羟基中夺取电子生成酪氨酸自由基。这些自由基二聚形成二酪氨酸键，最终形成致密的共价交联聚合物网络。同时，SPS再生Ru²⁺，维持催化氧化还原循环，确保自由基的持续生成。该UV驱动催化循环显著提高了聚合效率，促进了致密交联微球的形成。UV固化微球在PBS中表现出优于VIS固化微球的形态稳定性、尺寸均匀性和分散性。

利用该UV可固化S-HA-Tyr微水凝胶体系，研究人员在ZE21B镁合金上构建了多级多功能涂层。该涂层由耐腐蚀MgF₂中间层、聚多巴胺（PDA）粘附层和UV交联S-HA-Tyr微球组成。这种多级设计将腐蚀防护与生物活性水凝胶功能相结合，从而实现对镁降解和血管细胞反应的同步调控。该涂层显著增强了镁合金支架的生物功能活性，其机制包括促进内皮快速化、抑制平滑肌细胞增殖、调控巨噬细胞向抗炎M2表型极化，以及调节一氧化氮（NO）释放以维持血管稳态。

二、研究内容与结论

本研究开发了一种UV交联S-HA-Tyr@微球涂层，旨在解决可生物降解镁脑血管支架的两大主要局限：不可控降解和内皮化不足。首先，利用微流控技术制备了单分散S-HA-Tyr微球（40.75 ± 2.32 μm），然后通过Ru/SPS引发的光固化体系进行交联。与VIS固化相比，UV照射提供更高的光子能量和更高效的光化学活化，促进酪氨酸自由基的快速生成，形成更致密、更均匀的二酪氨酸交联网络。这种增强的交联显著改善了微球在生理条件下的稳定性、结构完整性和抗变形能力。

该涂层采用多级MgF₂/PDA/S-HA-Tyr@微球结构构建。MgF₂内层提供强电化学屏障，将腐蚀电流密度降低近两个数量级。PDA中间层通过儿茶酚介导的相互作用增强粘附力，确保微球的稳定锚定。S-HA-Tyr@微球外层通过模拟肝素样抗凝活性的磺酸基团赋予血液相容性，同时HA的持续释放支持内皮再生。与VIS固化体系相比，UV诱导的致密微球网络形成更连续、缺陷更少的涂层，有效限制电解质渗透并增强界面屏障性能。这三层共同克服了传统涂层难以同时实现结构均匀性、稳定性和生物功能性的局限。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要关键技术包括：微流控液滴生成技术，使用PDMS流动聚焦芯片制备单分散微球；Ru/SPS介导的光交联技术，分别采用可见光LED光源（400–450 nm，10 mW/cm2，30 min）和365 nm UV系统（20 mW/cm2，5 min）进行固化；多级涂层构建技术，依次通过氢氟酸处理形成MgF₂层、多巴胺自聚合形成PDA粘附层、微球自组装形成外层；纳米压痕技术评估涂层力学性能；电化学测试（动电位极化和电化学阻抗谱）评估耐腐蚀性能；体外细胞共培养模型评估血管细胞选择性调控。ZE21B镁合金由郑州大学河南省先进轻合金重点实验室提供，SD大鼠购自河南群博药物研究院有限公司。

四、研究结果

（一）微球形态稳定性与溶胀率分析

研究人员通过28天PBS浸泡实验系统评估了不同固化条件下S-HA-Tyr微球的长期形态稳定性。VIS固化微球在浸泡过程中逐渐出现结构不稳定，表现为溶胀、形态变形乃至部分崩解，表明VIS固化水凝胶网络交联密度较低、结构强度不足。相比之下，UV固化微球在整个28天观察期内保持良好球形形态，直径几乎恒定，溶胀率波动小于3%。这一优异的尺寸稳定性归因于UV照射下形成的致密二酪氨酸交联网络有效限制了PBS渗入水凝胶基质，从而防止结构变形。溶胀率定量分析显示，VIS固化微球浸泡约5天后直径显著增加，第28天溶胀率超过20%，而UV固化微球始终保持优异尺寸稳定性。

（二）复合涂层的形态与化学特征

SEM和OM观察显示，ZE21B合金表面存在典型金属切削纹路，MgF₂和MgF₂/PDA涂层表面光滑均匀。S-HA-Tyr@微球-VIS涂层中微球形状不规则、部分坍塌，表面粗糙、边界不均匀，表明VIS固化水凝胶网络交联密度较低。相比之下，S-HA-Tyr@微球-UV涂层展现出更明显的球形形态和更清晰的表面轮廓，微球在沉积后保持结构特征并在基底表面均匀分布。XPS分析确认了硫（S）信号的存在，VIS涂层硫含量为1.42%，UV涂层为0.82%；UV涂层氮含量从裸基底的0%增加到7.52 ± 0.5%，归因于PDA中间层的氨基和S-HA-Tyr结构中的酪胺基团。水接触角测量显示，UV涂层接触角降至2.1 ± 0.5°，形成超亲水表面，归因于S-HA-Tyr微球暴露的大量亲水官能团（羟基和磺酸基）。FT-IR光谱在约1052–1057 cm^-1处观察到磺酰基（SO₂）对称伸缩振动峰，确认两种涂层体系中均保留了S-HA-Tyr的磺化官能团。UV体系形成的致密、连续微球层不仅增强了结构完整性，还通过减少缺陷密度和限制电解质渗透路径显著改善了界面屏障性能。

（三）纳米压痕分析

纳米压痕测试定量评估了两种微球涂层的力学性能。S-HA-Tyr@微球-UV涂层的弹性模量（E = 58 GPa）约为VIS涂层（E = 18 GPa）的3.2倍；硬度（H = 3.2 GPa）约为VIS涂层（H = 0.9 GPa）的3.6倍。在达到可比压入深度前，UV交联微球可承受最大载荷2.78 mN，约为VIS处理组（0.15 mN）的20倍。恒载保持阶段分析显示，VIS处理样品在整个70秒保持期内压入深度持续增加（即蠕变），而UV交联网络未表现出明显的时间依赖性渗透行为。这些定量力学数据直接证明了UV诱导交联赋予的优异机械强度，建立了交联密度、机械强度和结构稳定性之间的直接联系。

（四）体外腐蚀与降解

在Hanks溶液浸泡1–14天的腐蚀行为研究中，S-HA-Tyr@微球-UV涂层在整个浸泡期间保持相对光滑的表面和较少的腐蚀特征，而VIS涂层在3天和7天后出现更明显的腐蚀沉积物和局部微裂纹，14天后差异更加显著。EDS分析显示腐蚀产物主要由钙（Ca）、磷（P）、镁（Mg）和氧（O）组成，表明浸泡过程中形成了含磷酸钙和碳酸盐的表面层。去除腐蚀产物后，VIS涂层表现出更大、更深的点蚀，而UV涂层点蚀较小且密度较低。FT-IR和XPS分析确认了碳酸盐（CO₃^2-）、磷酸盐（PO₄^3-）和羟基（-OH）的存在，表明不溶性矿物层的形成贡献了二次化学钝化。电化学测试显示，UV涂层腐蚀电位为-1.35 V，高于VIS涂层的-1.40 V；腐蚀电流密度低于VIS涂层。UV涂层将腐蚀速率降低了>85%，并在整个测试期间持续产生更少的氢气，表明更慢的腐蚀动力学和更可控的ZE21B降解过程。

（五）血液相容性测试

全血相互作用研究显示，VIS涂层表现出中等程度的血细胞粘附并偶见红细胞聚集，而UV涂层血细胞分布更均匀、聚集极低，红细胞形态无明显变形。血小板粘附实验中，VIS涂层表面血小板部分活化，表现为中等铺展和有限的伪足形成；UV涂层表面血小板基本保持球形、稀疏分布，活化水平显著降低。溶血率测定显示两种微球涂层均远低于5%安全阈值，其中UV涂层溶血率（0.19 ± 0.04%）低于VIS涂层。纤维蛋白原（Fbg）吸附实验表明，UV涂层的Fbg吸附量（0.13 ± 0.004）显著低于VIS涂层，且纤维蛋白原变性程度（0.20 ± 0.06）也较低，表明UV交联微球网络更好地维持了吸附纤维蛋白原的天然构象。OM和荧光成像进一步证实了UV涂层显著减少蛋白沉积、粘附细胞和血小板活化。这些改善归因于UV固化形成的稳定微球网络有效暴露带负电荷的磺酸基团（-SO₃^-）并增强表面水合作用。

（六）细胞相容性测试

内皮细胞（ECs）实验中，AO/EB染色显示UV涂层组活细胞密度更高、凋亡细胞极少。CCK-8定量分析确认UV涂层显著促进EC增殖。FITC-Phalloidin/DAPI染色显示，UV涂层上ECs在72小时后形成更致密、更互连的细胞网络。划痕实验表明，UV涂层组12小时伤口闭合距离（约120 μm）显著大于VIS组，24小时伤口闭合率约37%，证明UV交联微球涂层能更有效促进EC迁移。

平滑肌细胞（SMCs）实验中，UV涂层组细胞密度显著降低、细胞骨架延伸减少，CCK-8定量分析确认SMC增殖被显著抑制。免疫荧光染色显示，VIS涂层提取液培养的SMCs表现中等OPN表达和相对较低的α-SMA水平，部分向合成表型转变；而UV涂层提取液暴露的细胞OPN表达显著降低、α-SMA表达增强，表明收缩表型得到维持。UV组α-SMA荧光强度在所有组中最高。

巨噬细胞（MA）极化实验中，CD68/CD206双免疫荧光染色显示，VIS涂层提取液培养的巨噬细胞表现混合表型（中等CD68表达、弱CD206信号），而UV涂层提取液培养的巨噬细胞CD206表达显著升高、CD68染色极弱，表明以M2修复表型为主。细胞因子定量分析显示，UV涂层在24小时和72小时均降低TNF-α分泌（从59.20降至56.23 pg/mL，从93.53降至90.02 pg/mL），IL-10水平升高至85.76 pg/mL，表明强免疫调节作用。

ECs/SMCs共培养实验中，UV涂层在24、72和120小时均实现最高的ECs/SMCs比值（分别为2.95 ± 0.84、3.66 ± 0.99和2.01 ± 0.13），证明其在促进内皮化的同时持续抑制平滑肌细胞过度增殖。

（七）体内皮下植入分析

SD大鼠皮下植入7天后，SEM观察显示ZE21B合金出现严重局部腐蚀和深点蚀，而两种微球涂层均有效减轻腐蚀损伤。定量分析显示，UV涂层腐蚀坑面积（5.74–25.72 μm2）显著小于ZE21B组（76.36–267.13 μm2）和VIS组（33.60–202.36 μm2）。H&E染色组织学分析显示，ZE21B组诱导明显异物反应，纤维囊厚度达343.4 ± 40.53 μm，伴明显炎症细胞浸润和异物巨细胞。VIS涂层将纤维囊厚度降至261.2 ± 44.58 μm，UV涂层进一步降至134.2 ± 25.41 μm，表明对异物反应的抑制效果显著增强。

五、讨论与结论

UV交联S-HA-Tyr@微球涂层的优异性能主要由高能UV照射下增强的光化学交联效率所决定。UV照射提高了网络密度，改善了结构稳定性，优化了界面性能。该机制使得耐腐蚀性和生物功能得以同时增强，建立了清晰的结构-性能-功能关系。涂层在PBS中28天后保持≥97%结构完整性，而VIS固化微球表现≥20%变形，进一步证明交联密度增加直接增强结构稳定性和耐久性。

本研究建立了一种用于可生物降解镁基脑血管植入物的新材料设计范式，并可扩展到其他功能性微结构涂层。未来研究应聚焦于优化微球的降解动力学以匹配镁的腐蚀行为，并在生理相关血流动力学条件下评估其长期性能（>3–6个月）。该策略为降低支架内再狭窄风险和推进可生物降解镁合金脑血管支架的临床转化提供了有前景的途径。