深色化的地衣如何存活于干燥环境中：对肺衣（Lobaria pulmonaria）干燥过程及紫外线B辐射耐受性的转录组学解析

《Journal of Plant Physiology》：How melanised lichens survive drying: transcriptomic insights into desiccation and UV-B cross-tolerance of Lobaria pulmonaria

　　**摘要**
地衣以其出色的应对各种环境压力的能力而闻名，尤其是在干燥条件下。在自然环境中，地衣常常同时面临干燥和紫外线（UV）辐射的双重威胁。这种压力组合可能促进交叉耐受机制的发展，但关于地衣中这些机制的研究甚少。此前，我们发现紫叶地衣（Lobaria pulmonaria）在受到UV-B辐射时，会合成黑色色素黑色素，并伴随着基因表达和能量代谢的变化。本研究的目的是通过分析未经过UV-B处理（苍白型）和经过UV-B处理（黑色素型）的地衣对干燥和再水化的转录组及代谢组反应，来阐明地衣对干燥和UV-B压力的交叉耐受的分子基础。转录组分析显示，一组编码抗氧化酶、热休克蛋白以及次级代谢酶的基因在干燥和UV-B辐射作用下均上调。在干燥过程中，未经过UV-B处理的地衣中，编码抗氧化酶和次级代谢酶的微生物基因上调程度更高。此外，经过UV-B处理的地衣在干燥过程中积累了更多的阿拉伯糖醇，并表现出更高的光系统II（PSII）活性和相对电子传输率（rETR）。总之，我们的研究表明UV-B辐射会导致紫叶地衣产生多种反应，包括黑色素的形成，这些反应增强了地衣对UV-B和干燥压力的耐受性，从而揭示了交叉耐受机制的存在。

**引言**
地衣是真菌（微生物）与光合伙伴（光合生物）之间独特的共生关系——通常是绿藻或蓝细菌。作为变水生生物，地衣无法主动调节其体内的水分含量，因此其水分状态取决于环境条件（Kranner等，2008；Bhatt等，2024）。由于具有耐旱性，地衣能够在大多数维管植物无法生存的环境中存活。地衣体内水分含量的快速变化以及相应的生理活动（如呼吸作用和光合作用）的波动，取决于空气湿度或降水量（Hartard等，2009）。干燥会导致生物体内多种形式的损伤，包括膜不稳定、蛋白质变性以及活性氧（ROS）的产生（Kranner等，2005）。在光照条件下干燥时，光合作用的暗反应被抑制，而依赖光的光合作用反应仍会继续进行，导致ROS的积累（Gauslaa等，2012）。再水化过程也是一个伴随着氧化应激的关键时期——即所谓的“再水化氧化爆发”（Catalá等，2010；Expósito等，2019）。在自由生活的真菌中，干旱期间渗透溶质的积累起着关键的保护作用：甘油及其合成和运输受高渗透压甘油（HOG）信号通路的调控，该通路涉及MAP激酶Hog1p（Lee等，2013），以及海藻糖、甘露醇和其他多元醇（Ruijter等，2004；Al-Bader等，2010）。除了渗透溶质的积累外，防御蛋白的活性对多种生物的耐旱性也至关重要。热休克蛋白（HSPs）可以在干燥或渗透压胁迫期间稳定膜结构并防止蛋白质聚集（Tiwari等，2015）。在复苏植物中，耐旱性涉及编码晚期胚胎发生丰富（LEA）蛋白的基因表达与抗氧化酶、DREB、WRKY和MYB转录因子的活性协调，以及各种抗氧化剂、糖醇（多元醇）和其他糖类的积累（Oliver等，2020）。这些机制以时间调控的方式保护细胞结构和氧化还原平衡。虽然在真菌中尚未确认经典的LEA蛋白的存在，但已报道了类似LEA蛋白的亲水蛋白（Battaglia等，2008；Tunnacliffe等，2010）。在地衣中，只有绿藻光合伙伴中发现了LEA蛋白（Gasulla等，2021）。与地衣光合伙伴密切相关的陆生绿藻Trebouxiophyceae通过积累利比特醇和山梨醇等多元醇表现出持续的耐旱性（Holzinger和Karsten，2013；Hotter等，2018）。有趣的是，出于尚未完全理解的原因，地衣比其自由生活的伙伴具有更强的耐旱性：大多数地衣物种能够承受多次干燥-再水化循环，有些甚至在干燥数月后仍能恢复（Kranner等，2008）。地衣的耐旱性是通过组成性和诱导性机制的共同作用实现的。组成性机制包括高含量的多元醇、LEA和HSPs的存在、稳定光合膜的类囊体寡半乳糖脂以及强大的抗氧化系统（Gasulla等，2021）。诱导性机制包括HSPs的上调、非光化学淬灭的激活、脂质膜的重组以及细胞壁的重构。这种组成性策略使地衣能够快速响应水分含量的突然变化。对Flavoparmelia caperata地衣的研究揭示了一个两阶段再水化过程，涉及非功能性光系统II反应中心的转化和超氧化物歧化酶（SOD）活性的增加（Bhatt等，2024）。研究表明，原始森林中的喜湿地衣比世界广泛分布的物种更易受到长时间干燥的影响，且重新激活光合作用的时间更长（Osyczka等，2024）。

虽然关于地衣在干燥/再水化循环中的生理和生化变化已有大量描述，但关于基因表达变化的信息仍然非常有限。Junttila等人（2013）首次使用Cladonia rangiferina进行了地衣在干燥/再水化条件下的微阵列分析，观察到蛋白质折叠、解毒、糖和离子运输及细胞壁修饰相关基因的表达变化。另一项关于干燥诱导的基因表达变化的转录组研究针对的是沙漠地衣Endocarpon pusillum（Wang等，2015）。通过RNA-seq和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），作者发现了参与翻译、维生素B6生物合成、抗氧化防御、蛋白质折叠和降解、碳水化合物及谷氨酸代谢的基因上调。对Flavoparmelia caperata地衣在干燥和再水化过程中的Trebouxia gelatinosa的转录组分析显示，编码光合装置组分、ROS清除系统、HSPs和与干燥相关蛋白的基因表达发生了显著变化（Carniel等，2016）。

地衣经常暴露在极端条件下，如强烈的太阳辐射、温度和干燥（Backhaus等，2015），因此可以诱导出交叉耐受机制。在地衣中已描述了超过1000种次级化合物（Nguyen等，2013），许多次级代谢物可能在地衣生存中发挥重要作用。研究表明次级代谢物可以保护地衣免受生物胁迫（如病原体和啃食）和非生物胁迫（如紫外线辐射和高强度光合有效辐射（PAR）的影响（Molnár和Farkas，2010；Beckett等，2021）。然而，Ndhlovu等人（2022）使用丙酮冲洗方法无害地去除了干燥地衣中的次级代谢物，从而比较了含有和不含次级代谢物的地衣在干燥过程中的表现。结果显示，除了在抵抗高PAR和UV-B方面的已知作用外，地衣物质的存在还能减轻干燥应激的影响。其他可能增强对水分和UV耐受性的“交叉耐受”机制还包括初级代谢物的积累以及编码与压力相关蛋白的基因的激活，这些蛋白对耐受UV辐射和干燥至关重要。类似的功能在属于Syntrichia属的苔藓中也有发现。对Syntrichia的转录组和代谢组分析显示，UV辐射和干燥会引发重叠的反应。特别是，编码LEA蛋白和早期光诱导蛋白（ELIP）的基因参与了UV响应，UV处理还促进了与耐旱性相关的D-木糖和其他代谢物的积累（Ekwealor等，2021，2022）。此前我们发现，将紫叶地衣（Lobaria pulmonaria）暴露于UV-B辐射会导致地衣体变褐并积累黑色素（Daminova等，2022），并触发参与光保护性代谢物（如黑色素、黄酮类和萘衍生物）生物合成的基因上调（Leksin等，2024）。本研究旨在比较干燥/再水化对UV-B处理前后紫叶地衣基因表达和初级代谢物含量的影响。通过转录组分析和代谢组分析，我们完成了以下任务：（1）识别微生物和光合生物在干燥/再水化胁迫下的标记物；（2）发现苍白型和黑色素型地衣在耐受性方面的转录和生化差异。

**材料**
紫叶地衣（L. pulmonaria (L.) Hoff.）采集自俄罗斯科米共和国Syktyvkar郊外森林中的白杨树（Populus tremuloides Michx.）树干上（61.340°N, 50.330°E）。采集后，使用我们的先前协议（Leksin等，2024）对一半的地衣体进行了黑色素化处理。黑色素化的处理过程如下：再水化的地衣体储存在Binder KBWF-720气候箱中，在每日UV处理期间进行。

**光照/水分状态**
经过12小时硅胶干燥后，无论是否进行黑色素化处理，两种地衣体的RWC（相对水分含量）均为约54%（称为D1，50% RWC，50%干燥）；经过27小时干燥后，RWC分别为14%（称为D2，10% RWC，90%干燥）。在液态水中再水化1小时后，黑色素化地衣体的RWC恢复到81%，苍白型地衣体的RWC恢复到89%（称为R，85% RWC）（图1a）。

**讨论**
本研究探讨了干燥/再水化循环对未经过UV-B处理（苍白型）和经过UV-B处理（黑色素型）紫叶地衣（L. pulmonaria）的转录组和代谢组的影响。尽管UV-B辐射的影响远不止简单地诱导黑色素形成，但为方便起见，我们将地衣体分别称为苍白型或黑色素型。尽管在干燥/再水化循环期间，苍白型和黑色素型地衣的RWC和PSII活性仅有细微差别……

**结论**
本研究采用结合转录组和代谢组的方法，比较了未经过UV-B处理（苍白型）和经过UV-B处理（黑色素型）的紫叶地衣（Lobaria pulmonaria）对干燥/再水化胁迫的响应。对干燥/再水化循环期间转录组变化的详细研究表明，干燥会诱导编码抗氧化酶、酚氧化酶、渗透保护“HOG”通路相关酶和HSPs的基因，以及参与初级代谢的基因的上调。

**作者贡献声明**
Richard Beckett：撰写、审稿与编辑、可视化、监督、概念化。
Farida Minibayeva：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、概念化。
Ilya Leksin：撰写初稿、可视化、软件使用、方法学、研究、数据分析、数据管理、概念化。
Venera Khabibrakhmanova：软件使用、方法学、研究。

**未引用参考文献**
Ekwealor和Mishler, 2021; Jansen等, 1998。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的利益冲突。

**数据可用性**
本研究生成的数据可在NCBI GEO数据库中获取，访问编号分别为GSE306843（干燥和再水化）和GSE228186（UV处理）。

**致谢**
本研究得到了俄罗斯科学基金会的支持，项目编号为#25-24-00910（资助Ilya Leksin）。Venera Khabibrakhmanova、Richard Beckett和Farida Minibayeva感谢喀山生物化学与生物物理学研究所及俄罗斯科学院喀山科学中心的支持。感谢Vasily Babaev博士在MS分析方面提供的帮助。

**作者信息**
Ilya Leksin | Venera Khabibrakhmanova | Richard Beckett | Farida Minibayeva
俄罗斯科学院喀山生物化学与生物物理学研究所，P.O. Box 261，喀山 420111，俄罗斯联邦