《Journal of Virological Methods》：From Gibson Assembly to Cell-Free Expression: a guide to Recombinant Plasmid and Toscana Virus N Protein Production
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托斯卡纳病毒（Toscana virus, TOSV）的诊断因血清学工具有限而被低估。TOSV的N蛋白是关键的血清学靶标。研究人员采用了一种快速的Gibson Assembly策略以提高片段连接效率，并利用无细胞蛋白合成（cell-free protein s
托斯卡纳病毒（Toscana virus, TOSV）的诊断因血清学工具有限而被低估。TOSV的N蛋白是关键的血清学靶标。研究人员采用了一种快速的Gibson Assembly策略以提高片段连接效率，并利用无细胞蛋白合成（cell-free protein synthesis, CFPS）系统在16小时内生产出重组TOSV蛋白。旋转柱蛋白纯化法经济实惠，且无需特定设备。
**基于Gibson Assembly与无细胞表达平台的重组托斯卡纳病毒N蛋白生产体系研究解读**
**1. 研究背景与现存问题**
托斯卡纳病毒（Toscana virus, TOSV）归类于白蛉病毒属（*Phlebovirus*）*Phenuiviridae*科、布尼亚病毒目（*Bunyavirales*），是一种具有包膜、球形结构的负链单链RNA病毒。其基因组由大（L）、中（M）、小（S）三个片段组成，分别编码RNA依赖性RNA聚合酶、包膜糖蛋白和核蛋白（nucleoprotein, N）。TOSV感染虽多表现为亚临床或自限性发热，但也是引发中枢神经系统感染的重要病原，可导致无菌性脑膜炎和脑膜脑炎，在地中海沿岸地区具有显著的流行病学意义。目前全球有超过2.5亿人暴露于该病毒的风险之中，意大利、土耳其、希腊、科西嘉岛及北非地区均有循环报道。
然而，TOSV血清学诊断工具严重匮乏，目前仅有三种商业化试剂盒可用，即Sandfly fever virus Mosaic 1 IIFA（EUROIMMUN）、recomLine Bunyavirus IgG/IgM免疫印迹（Mikrogen）及Enzywell TOSV IgG/IgM ELISA（DIESSE）。由于TOSV感染常伴随短暂且低水平的病毒血症，血清学检测在感染诊断中占据核心地位。有限的商业化检测资源与病毒广泛流行之间的矛盾，凸显了开发更稳定、特异、经济的诊断试剂的迫切性。
在这一背景下，重组病毒蛋白成为提升血清学检测性能的关键资源。其中，TOSV核蛋白（N蛋白）尤为理想。N蛋白由S片段中759 bp序列编码，为非糖基化的253个氨基酸残基蛋白，是感染细胞和病毒粒子中含量最丰富的病毒蛋白，也是诱导机体产生IgM和IgG应答的主要抗原。多项研究表明，N蛋白编码序列在不同TOSV毒株间高度保守，仅存在极少数氨基酸取代，且以原型株为抗原的检测体系可有效识别不同谱系毒株感染产生的抗体。此外，在TOSV相关神经疾病中，针对N蛋白线性表位的抗体在急性和恢复期血清中均稳定检测到，进一步确证了N蛋白的免疫优势地位。
尽管N蛋白作为诊断靶标具有诸多优势，但从病毒增殖、基因克隆、重组质粒构建到重组蛋白表达与纯化的完整流程仍缺乏一套整合、优化的标准方案。现有操作信息零散分布于不同研究条件下完成的独立文献中，研究人员需要自行拼凑整合数据，尤其对于初次涉足重组病毒蛋白生产的实验室而言，实施完整的生产流程存在较大挑战。因此，该研究旨在建立一套快速、易用、可适配的完整工作流程，用于重组诊断抗原的早期评价，其中克隆和表达策略均可便捷地应用于多种目标基因构建。
**2. 主要关键技术方法**
研究人员开发并整合了从病毒增殖、基因克隆到重组蛋白表达与纯化的全流程方案。样本来源方面，研究人员使用了TOSV毒株RN_050724（第5代），该毒株分离自一名确诊阳性患者的脑脊液，其基因组已提交并分类为A系。主要技术方法包括：（1）基于Gibson Assembly的无缝克隆技术，通过设计含有末端同源重组的引物（20–40 bp），将N基因克隆至pT7CFE1-Chis质粒（Thermo Scientific?），该载体为优化用于无细胞蛋白合成（CFPS）的3.5 kb质粒，携带C端His
6标签；（2）大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化与菌落PCR筛选；（3）利用1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit（Thermo Scientific?）进行无细胞蛋白合成，于30°C、900 rpm振荡条件下反应16小时；（4）采用HisPur? Ni-NTA旋转柱进行重组蛋白纯化；（5）通过SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及Western blot对纯化蛋白进行鉴定和免疫原性验证；（6）使用Oxford Nanopore平台对重组质粒进行测序，确认关键调控区无突变或缺失。
**3. 研究结果与分析**
**3.1 Gibson Assembly及前期准备工作**
研究人员通过PCR扩增成功获得了N基因和线性化载体片段。PCR仅需少量优化，但扩增后的质粒和基因均需进行凝胶纯化。为提高回收效率，研究人员采用了薄胶（0.5–1%琼脂糖）、纵向切割、仅对含分子量标志物和第一条PCR产物的凝胶部分进行染色及紫外曝光定位目标条带等策略，最终使质粒DNA浓度达到>35 ng/μL，N基因浓度达到>20 ng/μL。
**3.2 转化大肠杆菌DH5α及质粒提取质量**
转化后选择性平板上长出58个菌落，对照组（不含有骨架载体）通常无克隆或仅极少量（约2–3个）。研究人员挑取30个菌落进行菌落PCR，其中10个（33%）为阳性。对阳性克隆进行小提质粒，DNA浓度均值为约192–229 ng/μL，A260/280比值约1.89–1.90，A260/230比值约2.13–2.25。其中经测序确认的单克隆进一步扩大培养进行大提质粒，浓度均值为约337–459 ng/μL，质量参数亦在理想范围内，表明该方法可获得高质量重组质粒DNA。
**3.3 Oxford Nanopore测序结果**
对重组质粒进行的纳米孔测序共产生15,357条reads，总测序碱基数达65,148,751 bp，平均读取长度为4,242.3 bp。通过与参考序列比对，确认关键调控元件中不存在突变或缺失，确保了表达构件的遗传完整性。
**3.4 DNA清洁、体外蛋白合成、纯化及Western blot分析**
DNA清洁后，质粒浓度在652.8–1138 ng/μL范围内，A260/280比值约1.82–1.89，A260/230比值约2.25–2.28，符合无细胞表达体系对模板DNA用量的要求（4000 ng）。经1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit进行16小时无细胞蛋白合成，随后采用HisPur? Ni-NTA旋转柱纯化。SDS-PAGE分析显示目标蛋白在约25 kDa处可见清晰条带，主要分布于洗脱级分3、4和5中，蛋白浓度分别为60、111和150 μg/mL。Western blot分析进一步证实了该重组蛋白的免疫原性，可在三份重复样本中稳定检测到目标信号，确认其为具有良好抗原性的TOSV N蛋白。
**4. 讨论与结论**
该研究建立了一套从病毒增殖至重组抗原验证的端到端完整操作流程，填补了现有文献中缺乏系统整合方案的空白。研究结果显示，Gibson Assembly方法有效避免了限制性内切酶位点的限制，仅需PCR扩增产物和组装预混液即可实现定向克隆，且采用3:1插入片段与载体摩尔比可获得满意克隆效率。转化过程无需额外优化，但研究人员强调在菌落PCR前增加菌落再划线步骤对于消除残留游离DNA导致的假阳性结果至关重要。小提与大提质粒在浓度和纯度参数上均表现优异，纳米孔测序进一步保障了表达构件的序列正确性。
在蛋白生产环节，基于HeLa细胞提取物的无细胞蛋白合成系统表现出良好的可操作性和时间效率，16小时内即可完成目标蛋白合成，100 μL小体积反应足以满足初步Western blot检测需求。Ni-NTA旋转柱纯化方案利用C端His
6标签实现了一步式纯化，研究人员将平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中的咪唑浓度分别调整为25 mM、20 mM和500 mM，并将溶液pH控制在7.0–8.0以确保组氨酸去质子化与镍离子有效结合。增加洗涤步骤至五次、洗脱次数最多八次，有效提高了高纯度蛋白回收率。尽管纯化结果并非完全最优，仍有部分非特异性蛋白存在于目标蛋白上方的洗脱级分中，但总体结果已满足后续应用需求。
研究结论明确指出：该方案能够以省时方式利用标准实验室设备高效生产可靠、病毒特异性的重组蛋白，为探索性研究和未来应用奠定了基础。Western blot分析结果进一步证明，所获得的重组N蛋白保留了良好的抗原性，可作为血清学诊断的适用工具。该方法的各个阶段可便捷地适配至其他病原体基因克隆和蛋白生产，具有跨病毒学、诊断学和生物技术领域的广泛适用性。研究同时指出，无细胞蛋白合成系统的显著局限在于蛋白质产量相对较低，在100 μL反应体系中最高可达750 μg/mL，因此不适用于需要大量蛋白样品的规模化生产场景；但对于早期诊断候选抗原的快速筛选与功能评价而言，该工艺流程无疑提供了一种高效、经济且易于推广的技术范式。
