《Marine Pollution Bulletin》：Zoological biobanks as a resource for microplastic analysis: a Py-GC-MS/MS case study on sea cucumbers
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动物生物库作为微塑料分析的一种资源：海参的Py-GC-MS/MS案例研究。动物生物库是微塑料监测中未被充分利用的资源。案例研究测试了储存或处理是否会导致假阳性结果。利用Py-GC-MS/MS对两种 archived 海参物种中的五种聚合物进行了定量分析。保存液
动物生物库作为微塑料分析的一种资源：海参的Py-GC-MS/MS案例研究。动物生物库是微塑料监测中未被充分利用的资源。案例研究测试了储存或处理是否会导致假阳性结果。利用Py-GC-MS/MS对两种 archived 海参物种中的五种聚合物进行了定量分析。保存液和操作过程中的污染处于低水平且可控。保守、稳健的工作流程支持基于生物库的污染监测。
**动物生物库标本用于微塑料分析的可行性研究——基于海参的Py-GC-MS/MS方法学验证与案例应用**
**一、研究背景与科学问题**
塑料污染已成为全球性环境问题。自20世纪70年代首次报道海洋塑料以来，塑料产量持续增长并不断刷新纪录。由于塑料降解缓慢，其在包括大气、陆地和 aquatic 生态系统在内的所有环境介质中不断累积。大块塑料制品经生物和非生物过程风化破碎形成微塑料（microplastics，MPs），也可直接以微小颗粒形式进入环境。海洋环境是微塑料的重要汇集区，塑料主要经内陆源由河流或大气传输进入海洋。
利用生物样品理解环境中污染物的累积状况具有重要价值。自2004年首次在片脚类、沙蠋和藤壶中描述微塑料以来，大多数研究已证实各类生物样品中均存在微塑料。然而，由于海洋环境的大规模采样成本高昂且实施困难，海洋生物体内微塑料累积的全球格局和时间动态仍缺乏系统记录。动物生物库（zoological biobank），包括博物馆中的自然历史标本收藏，仅美国就估计存有约10亿份动物标本，构成了在空间和时间两个维度上拓展采样的巨大潜在资源。这些标本通常为生物多样性研究而采集并保存于博物馆或研究机构，覆盖广泛的空间和时间尺度，包括难以采样的区域。然而截至2024年，仅有十项研究使用此类标本评估动物微塑料污染，且均未检验保存条件或操作过程中各种程序性因素（如分析过程中的外部污染或生物组织消化不完全）导致的假阳性检出假说。随着塑料污染研究中质量保证与控制（quality assurance and control，QA/QC）标准的日益严格，评估使用生物库标本时这一风险至关重要。
海参作为底栖沉积食性动物，通过摄取海底沉积物获取有机质，同时暴露于沉积于海底的微塑料等污染物。海参具有显著的沉积物再加工能力，如温带种Holothuria tubulosa每年可摄取3至17 kg/个体的沉积物，热带种Holothuria atra约为14 kg/个体/年，混合种群可达82 kg/m2/年。这种强烈的沉积物处理行为使海参不仅暴露于微塑料颗粒本身，还暴露于添加剂和沉积物吸附的化学物质。实验研究表明，微塑料摄入可影响海参的生理过程（如氧化应激、生长、免疫响应）并改变肠道微生物群落。因此，海参日益被视为沉积物相关微塑料污染的哨兵物种。
针对海参肠道微塑料分析的既有研究存在明显方法学局限：多数研究采用单一消化步骤去除有机质，部分研究结合密度分离去除肠道沉积物，但沉积物的存在及其贡献从未被讨论或表征；绝大多数研究采用目视预筛选结合红外光谱分析，可能偏向较大的可见颗粒而遗漏较小颗粒；部分研究甚至未验证聚合物组成；尚无研究采用热裂解-气相色谱-质谱联用（pyrolysis coupled with gas chromatography and mass spectrometry，Py-GC-MS）；质量保证与控制不足，增加了空气和表面颗粒污染的风险。基于上述局限，现有数据虽提供了关于微塑料污染的重要定性见解，但需开发适应生物库标本特性的可靠分析方法，以最大限度地减少污染和假阳性。
**二、研究目的与技术方法**
本研究以来自地中海和马赛湾浅水区的五种Holothuria tubulosa以及来自大西洋孔卡诺湾的四种Holothuria forskali为案例（共10个标本，均在2023年2月至3月由潜水员在6至20米深度采集，按照法国国家自然历史博物馆常规生物多样性调查程序处理，不经特殊防污染处理，以85%乙醇固定保存，在塑料桶中储存8个月），检验保存在动物生物库中的标本能否用于研究海底微塑料污染。研究方法基于Albignac等（2022）建立的Py-GC-MS/MS方法，可定量五种常见聚合物：聚乙烯（polyethylene，PE）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）、聚苯乙烯（polystyrene，PS）、聚甲基丙烯酸甲酯（poly(methyl methacrylate)，PMMA）和聚丙烯（polypropylene，PP）。主要技术方法包括：（1）对生物库容器中的保存液乙醇进行聚合物污染分析；（2）优化样品前处理流程，包括解剖提取肠道、冷冻研磨、KOH消化、过滤、再研磨等步骤；（3）通过质量平衡、元素分析和总脂质分析表征基质净化效率；（4）采用Py-GC-MS/MS定量分析五种目标聚合物；（5）通过加标回收实验、程序空白、重复性实验开展质量保证与控制。
**三、研究结果**
**3.1 生物库容器中保存液的微塑料污染**
对生物库中六种容器（玻璃罐、含塑料内衬的金属桶、塑料桶、塑料洗瓶）内的乙醇保存液分析显示，所有样品中均检出3至5种聚合物，浓度为0.05至0.45 μg·mL?1，平均总聚合物浓度为0.18（±0.15）μg·mL?1。PMMA最为普遍，在所有六个容器中均有检出，平均浓度为0.09 μg·mL?1；PE仅在一个容器中检出，浓度为0.23 μg·mL?1。这是首次研究保存液中微塑料的存在。鉴于保存液中检出微塑料，研究人员建议仅分析不直接接触保存液的内部器官，并选择肠道作为分析目标。
**3.2 样品特性认知对前处理方案定制和可靠数据解读的关键作用**
海参肠道同时含组织和沉积物，制备挑战显著。肠道组织因乙醇保存而脆化，无法将组织与沉积物分离；增加预过滤步骤去除沉积物的尝试效果不佳，且额外操作可能增加污染风险。研究最终采用方案#4：组织与沉积物一同消化处理。消化后质量平衡分析显示，无沉积物样品的质量消除效率达97.4%和97.6%，而含沉积物样品为44.9%和43.7%。元素分析表明有机碳消除效率为81.4%至99.1%。总脂质分析显示脂质清除率为88.3%至90.9%。针对PE检测的难点，研究采用基于长链二烯标记物（C19D至C25D，共六个标记物，排除存在共洗脱的C24D）的新策略，要求至少四个标记物浓度一致才认定PE存在，以保守估计确保特异性。
**3.3 海参肠道微塑料的综合分析**
加标回收实验（n = 3）显示：PE回收率为109%（标准差21%），PS为88%（标准差26%），PMMA和PP均为52%（标准差分别为17%和18%），PET为23%（标准差3%）。除PET在所有空白中显示较低背景污染外，各类型空白中的聚合物浓度均低于定量限或未检出。样品分析结果显示：PMMA仅在两个样品中检出且低于定量限；PP在两个样品中可定量，另五个样品检出但低于定量限；PS在全部10个样品中检出，其中4个样品可定量，孔卡诺标本浓度为3.8至44.6 μg/g干重（均值25.0），马赛标本为9.3至30.7 μg/g干重（均值14.5）；PET为最常检出的聚合物，在所有标本中均可定量，孔卡诺标本为5.1至35.5 μg/g干重（均值17.6），马赛标本为12.6至21.8 μg/g干重（均值16.1）。PE仅在M5样品中可定量，浓度为114.4 μg/g干重。
**3.4 实验重复性评估**
对C4和M4两个标本分别进行三次平行消化与分析。C4总聚合物浓度53.2至69.4 μg/g干重（中位数68.4），相对中位绝对偏差（relative median absolute deviation，rMAD）为1.6%；M4总聚合物浓度为16.6至41.9 μg/g干重（中位数19.1），rMAD为13.0%。PET、PE和PMMA的rMAD均低于15%。PP在C4中rMAD为33.2%，PS在M4中因一个重复浓度异常偏高（30.3 μg/g干重）而rMAD达73.4%。总体均质性良好，但PS例外。
**3.5 与现有文献的比较**
已发表的海参肠道微塑料研究中，最常报告的聚合物为PE、PET和PP，与本研究部分一致。浓度比较方面，文献中基于质谱法的其他海洋生物微塑料浓度（如贻贝20至187 μg/g、海产品可食部分40至300 μg/g）与本研究结果（9.4至169.2 μg/g干重）处于同一数量级（ppm级）。本研究分析的仅为肠道，若以全个体计，浓度可能更高。
**四、讨论与展望**
研究结果表明，即使肠道中不存在沉积物，微塑料仍可在海参肠道中持续存在，这可能与微塑料附着于肠道黏膜有关，但需受控实验验证。研究人员建议肠道微塑料研究报告应明确说明分析对象是肠道组织本身还是包含肠道内容物，并尽可能量化内容物。研究强调方法学标准需在严格性与灵活性之间取得平衡，以适应不同样品特性。当前方法已可定量五种占全球产量主要比例的聚合物，但聚乙烯醇缩丁醛（PVC）、聚氨酯（PU）和聚酰胺（PA）合计约占全球产量的20%，其在环境及海参肠道中也常见，将此类聚合物纳入方法体系需进一步筛选特异且丰度合适的裂解标记物。
动物生物库标本并非按统计设计的监测计划采集，常为机会性采集，但其作为互补资源，能拓展实验研究的时空范围。随着塑料向环境泄漏量预计到2040年将翻一番，理解过去微塑料累积动态可为预测未来塑料污染轨迹提供有价值的依据。
**五、研究结论**
本研究证明了尽管动物生物库标本存在特定限制（保存液、遗产价值、异质储存历史），只要仅分析内部器官并谨慎解读数据，生物库标本可用于微塑料分析。研究特别提示，即使在无沉积物的情况下，微塑料仍可在海参肠道中持续存在。通过提供包括可靠PE检测的保守策略在内的分步分析框架，该方法可应用于其他生物库来源样品。本研究为方法学可行性研究而非生态学研究，样本量有限（两个地点共10个标本、两种物种）、聚合物范围有限（五种目标聚合物）、缺乏同步环境基质（沉积物、水体）和详细保存历史记录，这些限制了对暴露-累积关系的评估能力。尽管如此，动物生物库标本覆盖广泛时空尺度，包括偏远或采样成本高昂的区域，若其时空异质性不妨碍稳健的时间序列分析，本研究为利用生物库时间序列重建微塑料累积的历史和当前动态开辟了道路。
