用于磁共振成像对比剂的具有可调T1-T2弛豫行为的单分散超小超顺磁性氧化铁纳米粒子的稳健水基合成

《Materials Today Chemistry》：Robust water-based synthesis of monodisperse ultrasmall SPIONs with tunable T 1-T 2 relaxometric behaviour as MRI contrast agents

　　

摘要翻译：超小超顺磁性氧化铁纳米粒子（ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles, USPIONs）作为磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）对比剂（contrast agents, CAs）的替代材料，因其优异的生物相容性和安全性备受关注。然而，现有合成路线在粒径控制、单分散性、规模化制备及临床转化方面仍面临重大挑战。本文研究人员报道了一种基于四甲基氢氧化铵（tetramethylammonium hydroxide, TMAOH）的新型共沉淀合成策略，用于制备具有高单分散性、优异胶体稳定性及可调磁共振弛豫性能的超小磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles, MNPs）。通过系统调控合成参数，包括TMAOH与铁离子比例、铁前驱体浓度、生长时间及反应温度，研究人员实现了对纳米粒子粒径（4.0-6.6 nm）的精确调控。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）与原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）表征证实所制备纳米粒子具有良好的结晶性与均匀的粒径分布。核磁共振弛豫（nuclear magnetic relaxation dispersion, NMRD）研究表明，随着粒径减小，纳米粒子表现出从T₂优势弛豫向T₁优势弛豫的转变，r₂/r₁比值从6.6 nm样品的3.3降至4.0 nm样品的1.8。3 T MRI成像实验进一步证实了粒径最小的样品（MNP-4.0）在T₁加权成像中呈现明亮信号，而较大粒径样品在T₂加权成像中表现出显著对比增强效果，显示出T₁-T₂双模态成像潜力。细胞毒性实验表明，所有样品与人胚胎肾细胞（human embryonic kidney, HEK）共孵育72小时后，细胞活力均保持在80%以上，且共聚焦显微镜观察显示纳米粒子呈时间依赖性的细胞内吞行为，主要分布于细胞质中。该合成方法简便、稳健、重复性高，无需使用表面活性剂、有毒溶剂或复杂设备，为USPIONs作为T₁-T₂双模态MRI对比剂的临床应用提供了可行的制备途径。

论文解读

一、研究背景

磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）作为一种非侵入性医学影像技术，凭借其优异的空间分辨率和软组织对比度，在临床诊断和生物医学研究领域得到广泛应用。MRI的成像效能显著依赖对比剂（Contrast Agents, CAs）的使用，其通过缩短组织中水质子的纵向（T₁）和/或横向（T₂）核弛豫时间来增强图像对比度。目前临床常用的钆基对比剂（Gadolinium-based Contrast Agents, Gd-CAs）主要通过缩短T₁弛豫时间，在T₁加权图像中产生明显的正性对比增强效果。然而，Gd-CAs存在一系列严重的安全隐患，包括在肾功能受损患者中引发肾源性系统性纤维化（Nephrogenic Systemic Fibrosis, NSF），以及钆离子在脑、骨骼和皮肤等组织中的长期蓄积。这些安全性问题促使监管机构日益严格审查，并推动了更安全替代材料的研发。

超顺磁性氧化铁纳米粒子（Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles, SPIONs）因其良好的生物相容性、可通过内源性铁代谢途径清除以及强磁响应性，被认为是在某些应用场景下替代Gd-CAs的极具潜力的候选材料。SPIONs在生物医学领域已展现出广泛的应用前景，涵盖诊疗一体化（theranostics）、再生医学磁性支架、磁泳分离、磁热疗肿瘤消融以及磁机械效应等。然而，传统SPIONs粒径相对较大，主要作为T₂对比剂发挥作用，在T₂加权图像中产生负性对比增强。这种成像模式在临床应用中存在特异性较低和潜在的诊断模糊性等不足。尽管已有Resovist和Feridex等基于SPION的商用T₂对比剂上市，但由于临床应用有限及T₁对比剂的竞争，这些产品最终从市场撤回。

近年来，研究焦点已转向超小超顺磁性氧化铁纳米粒子（Ultrasmall SPIONs, USPIONs），通常指核心直径小于约5 nm的氧化铁纳米粒子。在此尺度下，粒子表现出降低的磁化率和更快的水质子交换速率，有利于T₁弛豫机制，从而在MRI T₁加权扫描中产生正性对比增强。USPIONs由此兼具SPIONs的良好安全性特征和Gd-CAs的成像特性。此外，已有研究报道T₂-T₁和T₁-T₂双激活型MRI对比剂的获取可实现肿瘤病灶的高灵敏检测。

在USPIONs的合成方法中，热分解法虽能实现优异的粒径和结晶度控制，但存在试剂和设备成本高、使用有机溶剂、操作复杂及规模化受限等问题，不利于临床转化。相比之下，共沉淀法因操作简便、成本低廉、水相环境和可规模化等优势而备受关注。该方法的合成条件要求最低，可在室温或接近室温的温和条件下，以水为溶剂、采用低成本良性试剂，在最短时间内完成。其反应原理为Fe(II)和Fe(III)盐在碱性条件下按化学计量比反应生成磁铁矿（Fe₃O₄）纳米粒子。然而，标准共沉淀技术在合成USPIONs时面临重大挑战：由于快速且不可控的成核和生长过程，通常产生较大尺寸和多分散的纳米粒子。其中碱的选择起着关键作用：研究表明使用氢氧化钠会导致不可控成核和较大粒径，不适用于制备超小单分散SPIONs。其他策略如使用更复杂的螯合剂、表面活性剂或通过均相快速冷却反应混合物来猝灭生长，虽可改善尺寸控制，但也会增加合成复杂度，并可能损害可扩展性和环境兼容性。

二、研究内容

本研究旨在开发一种新型稳健的共沉淀合成方案，用于制备具有高单分散性、水相胶体稳定性以及有利于T₁-T₂双模态MRI应用的磁性能的USPIONs。该合成方法摒弃了表面活性剂、复杂螯合剂或精密设备，有望克服USPIONs作为T₁对比剂商业化应用转化的主要障碍。

研究人员首先以四甲基氢氧化铵（TMAOH）为碱，通过共沉淀法在室温和低温条件下制备磁铁矿纳米粒子。合成过程中，将FeCl₃与FeSO₄按2:1的严格化学计量比混合，加入TMAOH后溶液迅速由淡黄色变为黑色，标志纳米粒子成核的开始。与NaOH和NH₄OH等常用碱不同，TMAOH不会导致磁铁矿的即时沉淀，而是形成肉眼可见的稳定胶体悬浮液，这归因于[N(CH₃)₄]⁺在带负电的纳米粒子表面的吸附作用。

在生长时间1-5分钟后，向悬浮液中加入柠檬酸溶液以通过将pH从碱性降至弱酸性来猝灭纳米粒子生长。柠檬酸的吸附促进解聚集过程，在24小时内完成。通过对柠檬酸添加量的系统优化，研究人员确定了既能实现最小水合动力学直径又能保持最佳胶体稳定性的最优条件。合成完成后，通过透析或离心超滤去除有毒的TMAOH及多余柠檬酸，并通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）监控纯化进程。纯化后为提高长期分散稳定性，向体系中补充柠檬酸钠至pH 7.4，所得MNP@citrate在室温储存条件下可保持数周胶体稳定，且在磷酸盐缓冲液中24小时内水合动力学直径保持稳定。

研究人员系统考察了各合成参数对粒径的影响，包括TMAOH与Fe(III)的摩尔比、铁前驱体初始浓度、生长时间和反应温度。研究发现：TMAOH与Fe(III)的摩尔比从大于8降至4.8时，纳米粒子的平均水合动力学直径显著减小，但当接近化学计量比4时，样品可重复性变差。在室温和低浓度（[Fe³⁺]₀ = 15.6 mM）条件下，采用1分钟生长时间可获得最小粒径和最窄粒径分布。降低反应温度至0 °C可在两种测试浓度下均获得更小的纳米粒子。基于这些优化条件，研究人员制备了三种具有递进水合动力学直径的样品：MNP-6.6（16 nm）、MNP-5.3（10 nm）和MNP-4.0（5.7 nm）。

三、关键技术与方法

本研究采用了多种关键的实验表征技术：（1）动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）和ζ电位测量用于表征纳米粒子的水合动力学直径、粒径分布及表面电荷特性；（2）透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）用于表征纳米粒子的核心直径、核壳总尺寸及形貌；（3')高分辨透射电子显微镜（HRTEM）结合快速傅里叶变换（Fast Fourier Transform, FFT）分析晶格条纹以确认晶型；（4）核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）弛豫测量技术，包括快速场循环（Fast Field Cycling, FFC）和自旋回波序列，用于获取核磁共振弛豫色散（Nuclear Magnetic Relaxation Dispersion, NMRD）曲线；（5）3 T临床MRI扫描仪进行T₁和T₂加权成像；（6）电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）和邻菲罗啉分光光度法用于铁浓度定量；（7）MTT细胞活力测定法和共聚焦激光扫描显微镜用于生物相容性和细胞摄取评估。生物实验使用人胚胎肾细胞（Human Embryonic Kidney, HEK 293细胞）作为细胞模型。

四、研究结果

1. 合成与纯化：TMAOH制备的单分散USPION@citrate

研究结果表明，以TMAOH为碱的共沉淀合成可在室温和低温条件下形成稳定胶体悬浮液，不产生肉眼可见沉淀，与NaOH或NH₃作为碱的行为形成鲜明对比。DLS测量显示在过量TMAOH（[TMAOH]/[Fe³⁺] > 8）条件下，纳米粒子水合动力学直径仅为30-40 nm；当摩尔比降至4.8时，粒径降至17.5 nm。ζ电位测量显示，柠檬酸添加将等电点移至更酸性值（iep = 5.7降至更低值），证实柠檬酸吸附于粒子表面。ATR-FTIR光谱证实透析72小时后TMAOH特征峰（1488 cm^-1和950 cm^-1）显著减少，纯化后磁铁矿晶格特征峰（562 cm^-1）清晰显现。

2. 粒径调控：多参数优化

通过系统改变反应条件，研究人员发现：初始Fe(III)浓度从156 mM降至15.6 mM并配合1分钟生长时间，可获得更小粒径（12 nm vs 24 nm，DLS测量）和更窄粒径分布（σ_D = 5 nm vs 12 nm）；反应温度从室温降至0 °C可进一步减小粒径，在低浓度条件下获得粒径仅7 nm的样品；而60 °C反应温度导致样品高度多分散且快速失稳。

3. 粒径对核磁弛豫性能的影响

磁共振弛豫研究表明，随着核心直径从6.6 nm降至4.0 nm，纵向弛豫率（r₁）和横向弛豫率（r₂）均显著降低，体现了核磁弛豫性质对纳米粒子粒径的强依赖性。r₂/r₁比值在1.34 T场强下从3.3（MNP-6.6）经2.9（MNP-5.3）降至1.8（MNP-4.0），表明粒径减小时体系从T₂优势型向T₁优势型弛豫系统过渡。NMRD曲线特征也支持这一结论——MNP-6.6和MNP-5.3在约10 MHz处呈现典型的超顺磁纳米粒子r₁最大值，而MNP-4.0的最大值则移至20-30 MHz范围且特征减弱。

4. 3 T MRI成像验证

3 T MRI成像实验进一步验证了弛豫研究结论。在T₁加权图像中，MNP-4.0样品呈现最亮信号，确认其作为正性对比剂的能力；MNP-6.6和MNP-5.3虽然在性质上仍主要作为T₂弛豫剂，但也表现出可观的T₁弛豫能力，适合作为双模态MRI对比剂。通过信号强度分析估算的弛豫率显示，MNP-6.6、MNP-5.3和MNP-4.0在3 T场强下的r₂/r₁比值分别为8.5、6.7和3.7。

5. 细胞培养基中的胶体稳定性

在含胎牛血清的DMEM培养基中，MNP-6.6的水合动力学直径从纯水中的16 nm增至30 nm，ζ电位从-30 mV上升至-13 mV，提示蛋白质冠（protein corona）在纳米粒子表面形成，增强了高离子强度条件下的胶体稳定性。

6. 细胞相容性与细胞摄取

细胞活力测定显示，HEK细胞与浓度高达140 μg/mL的MNP共孵育72小时后，细胞活力保持>80%，且在最大测试浓度下也未观察到明显细胞毒性。对照实验排除了游离柠檬酸的干扰。共聚焦显微镜观察显示，MNP在4小时时细胞内信号微弱，24小时后呈现显著的胞质内蓄积，表明纳米粒子呈时间依赖性内吞行为。

五、结论与讨论

本研究开发了一种简便、稳健且可重复的共沉淀合成方法，成功制备了具有可控粒径分布和优异水相胶体稳定性的球形超小磁铁矿纳米粒子。该方法的核心创新在于TMAOH作为碱的独特作用——它不仅提供碱性环境，还同时充当胶溶剂（peptizing agent），有效防止粒子聚集。粒子尺寸可通过调节前驱体浓度、反应温度和生长时间轻松调控。TMAOH在最终产品中被完全去除，替换为高生物相容性的柠檬酸涂层（约1 nm厚），确保了纯化后纳米粒子的长期悬浮稳定性（在3 T磁场下仍保持稳定）。

研究证实，随着粒子尺寸减小，纳米粒子表现出预期的从T₂优势型向T₁优势型弛豫的转变，在保证SPIONs安全性的同时兼具类似Gd-CAs的正性对比增强特性。DLS和ζ电位测量提示蛋白质冠的形成可能是在生理离子强度条件下增强纳米粒子稳定性的关键原因。生物相容性实验证实MNP在HEK细胞中表现出良好的细胞耐受性和时间依赖性细胞摄取能力，为后续作为MRI对比剂的进一步临床前评估提供了坚实的实验基础。该合成方法不使用表面活性剂、复杂螯合剂或有毒溶剂，环境友好且有望规模化放大，克服了USPIONs从实验室研究向临床应用转化的主要障碍，为开发新一代安全高效的T₁-T₂双模态MRI对比剂提供了可行且实用的技术方案。