《Methods》：A formal Bayesian decisional framework for automated cell subset assignment in multiparametric flow cytometry: The LBC-flow approach
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摘要多参数流式细胞术（MFC）数据分析仍然在很大程度上依赖于专家依赖的主观手动门控策略。尽管无监督聚类方法提高了数据利用效率，但尚未提出一个正式的概率决策框架来处理后续的关键步骤，即细胞亚群的分配和定量。LBC-Flow（专利待审）是一个基于FlowSOM聚类的结构化朴素高斯贝叶
摘要
多参数流式细胞术（MFC）数据分析仍然在很大程度上依赖于专家依赖的主观手动门控策略。尽管无监督聚类方法提高了数据利用效率，但尚未提出一个正式的概率决策框架来处理后续的关键步骤，即细胞亚群的分配和定量。
LBC-Flow（专利待审）是一个基于FlowSOM聚类的结构化朴素高斯贝叶斯决策框架。与黑盒机器学习方法不同，每个分类决策都是完全可解释的、明确的，并通过其后验概率值进行数学证明。必须从正常体液中构建一个包含所有细胞分布参数的参考模型，从而能够计算每个细胞的后验概率。未能达到预定义接受阈值的细胞被标记为新的特定类别——不可分类事件（NCE）。
使用白细胞差异检测面板对36个血液样本进行了概念验证。比较了五种分析策略：手动门控、仅使用FlowSOM进行定量，以及三种贝叶斯分类方法（即基于节点的BDN、基于细胞的BDC和基于高斯的BCGC）。通过使用类内相关系数ICC(3,1)和Z分数进行比较，BCGC在处理稀有亚群时表现出优于其他方法的性能。每个样本的26个识别出的白细胞亚群和NCE的完整结果在30秒内得出。
LBC-Flow是一个原创的正式贝叶斯决策框架，明确解决了无监督聚类输出与可重复的细胞亚群分配和定量之间的差距。该框架设计上是与特定检测面板无关的，可以为临床或研究环境中的其他流式细胞术数据集提供方法论基础。
引言
经典的多参数流式细胞术（MFC）是一种强大的方法，用于分析体液中的离散细胞亚群，基于它们通过荧光标记的单克隆抗体表达的分化抗原。在获取所有细胞事件后，使用单参数和双参数显示来分析光散射和平均荧光强度（MFI）的电子信号。然而，这种分析依赖于操作者依赖的门控策略来选择感兴趣的细胞群。尽管有Infinicyt?、FlowJo?或Kaluza?等软件工具可以制定特定检测面板的协议，但这一分析步骤仍然耗时且具有主观性。
随着时间的推移，已经开发了几种基于人工智能（AI）的标准MFC (.fcs) 文件的后处理策略[1]。这些策略主要包括降维方法（PCA、t-SNE、UMAP）或无监督聚类算法（SPADE、k-means、Phenograph）。20世纪80年代初引入的Kohonen自组织映射（SOM）在2015年被用于设计FlowSOM工具[3]。在对比各种聚类方法时，FlowSOM被认为是最快且最稳健的算法[4]。它能够对具有相似光散射和免疫表型特征的细胞亚群进行敏感的聚类。FlowSOM结果的解释依赖于根据细胞亚群的特性识别元群。使用Kaluza?等软件可以实现更精确的节点分配[5]，[6]。这种方法已在临床应用中成功实施[7]，[8]。
然而，仍然存在一个根本的方法论差距。这里提出的问题可以正式表述如下：给定一组由特定MFC参数描述的单一细胞事件，如何自动且可重复地将每个细胞分配到预定义的细胞亚群中，并明确量化分类的不确定性，而无需人工监督输出？实际上，现有的无监督方法缺乏将簇直接分配到特定命名细胞亚群的能力，也无法量化给定细胞属于某个定义群体的概率。
LBC-Flow（专利待审）旨在解决这一差距。它结合了FlowSOM聚类和在正常样本参考数据集上训练的朴素高斯贝叶斯分类模型。对于任何样本中的每个细胞，都会计算其属于任何预定义亚群的后验概率，并与明确的接受阈值进行比较。关键的是，未能达到这些阈值的细胞被标记为不可分类事件（NCE），这是现有方法中不存在的一个类别。因此，它提供了一个质量指标和异常细胞群体的潜在标志。与黑盒机器学习方法不同，LBC-Flow中的每个分类决策都是完全可解释和可数学追踪的。
提供了一个应用于外周血（PB）样本的白细胞差异检测面板作为概念验证，展示了这种与特定检测面板无关的框架在临床相关环境中的实际应用。
章节摘录
材料与方法
以下方法是在外周血白细胞差异检测的背景下描述的，作为概念验证。然而，LBC-Flow框架与特定检测面板无关，可以直接应用于任何MFC数据集。
结果
如上所述，图1中描述的一般LBC-Flow过程被应用于免疫表型PB差异检测“LBC-Flow diff”，作为其潜在实际应用的例子。
通用原则
LBC-Flow是一个原创的框架，明确解决了无监督聚类输出与正式概率细胞亚群分配之间的差距，将FlowSOM嵌入到一个具有明确接受阈值的结构化贝叶斯决策系统中。
LBC-Flow过程代表了标准化MFC实践的一种新颖方法尝试。到目前为止，MFC主要关注仪器间标准化/协调[13]，[14]以及检测面板提案[15]。同时，如
结论
LBC-Flow提供了一个原创的正式贝叶斯决策框架，明确弥合了无监督FlowSOM聚类与MFC中可重复细胞亚群分配之间的差距。在这里应用于外周血白细胞差异检测作为概念验证，它在每个样本中不到30秒的时间内识别出26个免疫表型亚群，尤其是对于稀有亚群，比手动门控更高效。对NCE的明确处理提供了一个强大的内置质量指标。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Benoit Dupont与Beckman Coulter Life Sciences有包括就业关系在内的关联。Francis Lacombe拥有专利待审。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢Alexandre Resplandy、Sollenn Marinier、Josiane Lacombe和Damien Carron在技术和后勤方面的帮助，以及Samuel Granjeaud在讨论中的宝贵意见。
Francis Lacombe|Benoit Dupont|Gilbert Carron|Marie-Christine Béné
LBC-Lab, 47bis Rue des Puddleurs, 71200 Le Creusot, France
