《Molecular Catalysis》：Structural remodeling of glutamate decarboxylase through P60-induced “Hug” model dimerization for superior substrate affinity and stability
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•P60-GAD融合酶形成了一个稳定的“Hug”型同源二聚体，具有更高的刚性。•P60-GAD的催化效率（kcat/Km）比野生型GAD高3.6倍。•P60-GAD在15个循环后仍表现出更高的pH稳定性和88.8%的活性保留率。•MD模拟显示P60-GAD的静电互补性得到了优化。
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P60-GAD融合酶形成了一个稳定的“Hug”型同源二聚体，具有更高的刚性。
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P60-GAD的催化效率（kcat/Km）比野生型GAD高3.6倍。
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P60-GAD在15个循环后仍表现出更高的pH稳定性和88.8%的活性保留率。
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MD模拟显示P60-GAD的静电互补性得到了优化。
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MM/GBSA计算确认P60-GAD对底物的结合亲和力有所提高。
引言
γ-氨基丁酸（GABA）是一种非蛋白质生成的氨基酸，在动物、植物和微生物中广泛存在，是中枢神经系统中的主要抑制性神经递质[1,2]。它具有多种生理功能，包括调节神经活动、血压[3]以及改善肝肾功能，因此在食品、医药和农业领域有广泛应用[4]。在工业上，GABA作为合成环保塑料（如N-甲基吡咯烷酮（NMP）和聚酰胺4（PA4）的生物基前体，提供了一种不依赖石油的生产途径[5]。在农业中，GABA通过减轻害虫和环境压力造成的损害来增强植物的抗逆性和存活能力[6]。在畜牧业中，它被用作饲料添加剂，以增加日摄入量、改善生长表现并增强免疫力。GABA可以通过化学合成、植物富集和生物合成方法生产[7]。最近，使用纯化的谷氨酸脱羧酶（GAD）或表达GAD的重组微生物，已经实现了高效的GABA生产[8,9]。这种生物转化方法为直接发酵生产GABA提供了一种更具经济可行性的替代方案[10]。
谷氨酸脱羧酶（GAD）以吡哆醛5′-磷酸（PLP）为辅因子，催化l-Glu或其钠盐的脱羧反应生成GABA和CO2，因此它是GABA生物合成中的关键酶[11]。因此，提高GAD的活性和稳定性对于高效生产GABA至关重要。野生型GAD的活性常受到温度、pH值和生物素浓度等因素的限制[12]。人们已经投入了大量努力通过酶工程来提高催化效率和GABA产量[12]，最近的技术进步进一步扩展了提高生物催化剂性能的工具箱[13]。为了克服其在可持续工业应用中的局限性，采用了各种分子策略来增强不同生物来源的GAD的催化效率和热稳定性。例如，Thu Ho等人[14]将拟南芥（Arabidopsis thaliana）GAD中的第62位苯丙氨酸替换为丝氨酸，得到的T62S突变体具有更高的催化活性，并且在热稳定性和pH稳定性方面比野生型酶分别提高了19%和4%。2019年，Fang等人[15]对短乳杆菌（Lactobacillus brevis）的GAD进行了脯氨酸替换改造，得到了稳定的G364P突变体，其半失活温度提高了5.3°C，55°C下的半衰期延长了19.3分钟。Pennacchietti等人[16]发现His465残基在弱碱性条件下会与PLP结合并阻塞活性位点，从而失活GadB。为了打破这种“锁定”机制，他们创造了GadBH465A和GadBΔHT突变体，从而消除了酶的pH依赖性切换现象。尽管进行了优化尝试，但现有方法往往涉及复杂的理性设计，或者产生的突变体与野生型酶相比没有显著改善。因此，仍然需要一种通用且简单的方法来同时提高GAD的活性和稳定性。
同源二聚化已成为提高酶催化效率和热稳定性的创新策略[17]。这种方法利用结构对称性来优化活性位点的可及性，并在亚基之间提供协同稳定作用。常见的二聚化方法包括工程化的二硫键、亮氨酸拉链基序以及与自组装肽的融合。值得注意的是，基于融合的二聚化方法通过模块化结构设计实现对空间排列的精确控制。Zhang等人[18]报道，将双功能甲酸脱氢酶（FDH）与亮氨酸脱氢酶通过灵活的连接剂融合，使酶活性提高了1.2倍。这一改进归因于SAPs的疏水-亲水平衡，促进了酶的正确折叠和底物结合位点的预组织。Liu等人[19]通过将锚定肽LCI与热稳定的角质酶Tfuc2结合，构建了一种融合蛋白，其PET水解效率比自由酶提高了1.8到34.5倍，这得益于LCI的高结合亲和力和灵活的振荡行为。单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的P60蛋白具有适用于此类应用的独特结构特征[20,21]。其N端结构域（残基1-150）包含一个负责底物识别的Ig样β-桶结构[22]。在这项研究中，P60蛋白的这一特定N端结构域（P60，残基1-150）被策略性地与GAD融合，形成了一个能够自发形成同源二聚体的嵌合酶P60-GAD。
此外，全细胞催化因具有较高的生物催化性能而被广泛用于GABA合成[23]。2012年，Ma等人[24]鉴定出埃希菌（Escherichia coli）中的膜转运蛋白GadC，属于APC（氨基酸/多胺/有机阳离子）超家族。GadC有助于l-谷氨酸的底物吸收和产物GABA的出口。GadC与GAD共同构成了埃希菌的关键耐酸机制，使细菌能够在强酸性条件下存活至少两小时[25]。Tian Lingzhi等人[26]通过迭代诱变和筛选获得了高活性的GAD突变体L. plantarum GB01–21，该突变体在埃希菌中的表达量很高，24小时生物转化后GABA浓度达到204.5 g/L，转化率为97.32%。Shi XF等人[27]优化了短乳杆菌TCCC 13,007的全细胞催化条件，在10小时内从80 g/L的谷氨酸和240 g/L的谷氨酸钠中获得了201.188 g/L的GABA浓度，转化率为99.4%。Ke等人[28]使用表达来自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的GadB的重组埃希菌作为全细胞生物催化剂，12小时内获得了308.96 g/L的GABA产量，转化率为99.9%。Xue等人[29]证明GadB的出口或潜在转运可以缓解生物转化过程中的限速步骤，实现了底物到GABA的完全（100%）转化。这些全细胞系统展示了基于GAD的生物催化的工业潜力，激发了我们通过蛋白质工程进一步优化GAD性能的努力。
本文提出了一种新的融合方法，利用P60蛋白的截短N端结构域（残基1-150）来增强谷氨酸脱羧酶（GAD）的催化性能和稳定性。将P60片段通过基因工程整合到GAD的N端区域，从而构建了一种稳定的生物催化剂。所得到的嵌合酶P60-GAD表现出显著增强的功能特性。这种修饰增强了构象稳定性并优化了底物的可及性。详细的分子模拟表明，P60结构域增强了亚基间的连接性，形成了支撑观察到的动力学改进的“Hug”架构。全细胞催化的P60-GAD在变化的pH和温度条件下表现出更高的催化活性，证明了其在可扩展GABA生物合成中的适用性。此外，这种肽辅助稳定方法为增强其他多聚体酶系统提供了通用平台。
章节片段
使用P60肽工程化GAD（P60-GAD）
重组表达系统的分子构建采用标准克隆程序完成。对于基因操作，使用大肠杆菌 DH5α作为质粒繁殖的宿主，而蛋白质生产则在大肠杆菌 BL21 (DE3)细胞中进行。编码谷氨酸脱羧酶的GAD基因是从短乳杆菌基因组DNA（GenBank: TIGR01788.1）中利用特定引物（gadB-F: 5′-AGAAGGAGATATACATATGATTAATAATGTGG-3′; gadB-R: 5′-TGCTCGAGACTTCGAACGGT-3′）通过PCR扩增获得的
GAD和P60-GAD的催化性能
研究了GAD和P60-GAD的最佳pH值和温度。如图1a所示，两种酶在pH 5.0时表现出峰值活性，表明P60融合并未改变谷氨酸脱羧酶的pH最适值。值得注意的是，P60-GAD和野生型GAD的pH-活性曲线几乎相同，但在pH值高于6.0时活性急剧下降。然而，P60-GAD在较宽的pH范围（4.0–5.5）内表现出显著更高的酶活性
讨论
在本研究中，我们通过将Listeria P60蛋白的N端结构域（残基1-150）与谷氨酸脱羧酶基因融合，开发了一种名为P60-GAD的融合酶。这种改造诱导了一种新的“Hug”型同源二聚体，协同增强了催化活性和结构稳定性，解决了野生型GAD在工业GABA生产中的关键局限性。
结论
在这项工作中，我们通过利用截短的P60肽驱动了一种新的“Hug”模型二聚化，开发出高性能的生物催化剂P60-GAD。这种结构改造使催化效率提高了3.6倍，并且在广泛的pH和温度范围内具有更强的稳定性。分子研究表明，P60介导的“Hug”界面优化了活性位点的静电特性和亚基间的通讯，显著降低了底物结合的能垒
CRediT作者贡献声明
崔秀文：验证、方法学、研究、数据分析、数据整理。张月：写作 - 审稿与编辑、初稿撰写、数据分析、监督、资金获取。齐家坤：方法学、数据分析。普中骥：写作 - 审稿与编辑、初稿撰写、数据分析、监督、资金获取。陈明：数据分析、监督、资金获取。张春志：写作 - 审稿与编辑、数据分析、监督、资金获取。
崔秀文|张月|齐家坤|普中骥|陈明|张春志
