人类组蛋白去乙酰化酶相互作用组的多复合物整合结构建模

《Molecular & Cellular Proteomics》：Multicomplex Integrative Structural Modeling of a Human Histone Deacetylase Interactome

　　

组蛋白去乙酰化酶（HDAC）1和2是多种大型染色质重塑复合物（包括NuRD、SIN3和CoREST）中的关键酶组分。此外，HDAC1和HDAC2均在其C末端结构域（CTD）内包含一个较大的内在无序区域（IDR）。HDAC1/2如何组装成这些复合物以及CTD IDR的结构仍知之甚少。在此，研究人员使用HDAC1/2从细胞中分离其蛋白质相互作用网络，并使用交联质谱（XL-MS）结合整合建模平台构建了NuRD、SIN3A和CoREST复合物的结构模型。接下来，研究人员实施了一种AlphaFold增强的XL-MS约束建模方法来研究HDAC1如何组装到这些复合物中。研究表明，HDAC1的CTD IDR在这些复合物中折叠成α螺旋。最后，研究人员构建了一个完整的NuRD亚复合物整合结构模型，包括丰富的HDAC1:MBD3:MTA1:GATAD2B:RBBP4亚基，其中包含6个IDR。本文所使用的方法广泛适用于蛋白质复合物和蛋白质相互作用网络的研究，可为IDR提供重要见解。

人类组蛋白去乙酰化酶（HDAC）相互作用组的整合结构解析：多复合物模型构建及内在无序区域的结构表征

**研究背景与科学问题**

I类组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2主要定位于细胞核，具有强烈的去乙酰化酶活性，参与多种疾病进程，包括几乎所有类型的癌症。两者作为多种大型转录共抑制复合物（包括CoREST、MIER、NuRD和SIN3）的酶催化核心组分，调控细胞分化、DNA损伤应答、细胞周期、增殖等关键生物学过程。尽管HDAC1和HDAC2具有高达85%的序列相似性，但研究表明二者在发育阶段调控、干细胞多能性维持及癌症进展中发挥不同的功能。

目前HDAC1和HDAC2的晶体结构仅覆盖了大部分去乙酰化酶结构域（分别覆盖氨基酸8-376和1-367），而约100个氨基酸的C末端结构域（CTD）由于序列差异最大且呈现内在无序特征，在所有已解析的X射线晶体结构中均未被解析。因此，HDAC1约22%和HDAC2约23%的序列在结构上仍未被表征。HDAC1/2所在复合物的多个亚基同样含有内在无序区域（IDR），例如NuRD复合物中的MBD3、MTA1、GATAD2B等。由于IDR难以通过传统结构生物学方法研究，这些无序区域如何在复合物组装中折叠成功能构象仍是未解之谜。

整合结构建模（ISM）是一种强大的蛋白质复合物研究方法。研究人员此前已通过冷冻电镜（cryo-EM）与交联质谱（XL-MS）结合的方法完全解析了酿酒酵母Sin3大复合物的整合结构模型，将序列覆盖率从约50%提升至100%，并展示了XL-MS检测和建模IDR的能力。然而，人类HDAC1/2复合物中IDR的结构表征仍属空白。本研究旨在利用XL-MS结合ISM对HDAC1/2的蛋白质相互作用网络进行系统结构解析，并重点探究CTD IDR在复合物环境中的折叠行为。

**主要研究内容**

研究人员利用稳定表达HDAC1-Halo和HDAC2-Halo的HEK293细胞系进行亲和纯化，结合DSSO可裂解交联剂处理，通过XL-MS构建了HDAC1和HDAC2的直接蛋白质相互作用网络。基于得到的交联数据，研究人员利用整合建模平台（IMP）分别构建了NuRD、SIN3A和CoREST三个转录共抑制复合物的整合结构模型。此外，研究人员采用AlphaFold3预测与XL-MS约束HADDOCK分子对接相结合的策略，研究了HDAC1（包括此前未解析的CTD IDR）在不同复合物环境中的折叠构象，并最终构建了包含HDAC1:MBD3:MTA1:GATAD2B:RBBP4五个亚基、含有6个IDR的NuRD亚复合物完整整合结构模型。

**关键技术与方法**

本研究使用的样本为稳定表达Halo标记HDAC1和HDAC2的Flp-In?-293细胞（来源于HEK293T细胞，购自ATCC），每种细胞设置三个生物学重复。关键技术方法包括：①HaloTag磁珠亲和纯化结合DSSO（双琥珀酰亚胺亚砜）可裂解交联剂的AP-XL-MS技术，使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行MS2-MS3数据采集，并利用Proteome Discoverer v2.4中的XlinkX节点进行交联肽鉴定；②基于Python建模接口（PMI）的整合建模平台（IMP），采用贝叶斯交联约束、EM密度约束、最小距离结合约束、排除体积约束和序列连接性约束进行多尺度结构采样与验证；③AlphaFold3蛋白质结构预测服务器用于预测HDAC1与各相互作用伙伴的复合物结构；④HADDOCK2.4分子对接平台，将XL-MS衍生的距离约束转化为模糊相互作用约束以引导对接过程。

**研究结果**

**1. HDAC1和HDAC2的XL-MS蛋白质相互作用网络**

通过整合三个HDAC1-Halo和三个HDAC2-Halo的XL-MS数据集，分别获得1471个和1187个交联谱图匹配（CSM），涵盖了359个不同蛋白质之间的596个非冗余交联。交联蛋白被分为已知复合物成员、已知HDAC1/2相互作用蛋白、组蛋白相互作用蛋白、细胞核定位蛋白及其他蛋白等类别。已知相互作用蛋白的CSM范围显著大于其他蛋白，表明亲和纯化结合DSSO交联有效富集了生物学相关的相互作用。交互网络分析鉴定了多个蛋白节点（≥5个独特蛋白相互作用子），包括HDAC1、HDAC2以及CHD4、GATAD2B、MBD3、MTA1、MTA2、RBBP7、MIER1、KDM1A和SIN3A等。值得注意的是，未检测到核心组蛋白与HDAC1/2复合物亚基之间的分子间交联，可能归因于组蛋白尾部赖氨酸侧链的大量翻译后修饰。

**2. NuRD复合物的交联引导组装**

在NuRD复合物模型中，研究人员选用交联最多的HDAC1、GATAD2B、MBD3、MTA1和RBBP4作为核心亚基，化学计量比为2个MTA1、2个HDAC1、4个RBBP4、1个MBD3和1个GATAD2B。整合建模产生了有效单一聚类（占总模型97%），模型精度为55 ?，99%的输入交联得到满足，与EM图谱的交叉相关性为0.86。结构分析显示，MTA1-HDAC1二聚体构成复合物的支架，斜向契合在EM密度图中；MBD3的N端甲基-CpG结合结构域（MBD3N）定位于MTA1-HDAC1二聚体的两个对称结合位点；MBD3-GATAD2B的卷曲螺旋结构域（MBD3CC-GATAD2BCC）位于MTA1二聚化界面上方。精度分析表明MTA1-HDAC1二聚体、MTA1BAH结构域和MTA1-RBBP4二聚体以高精度定位，而MBD3、GATAD2B、MTA1mid和HDAC1C则定位精度较低。

**3. SIN3A复合物的交联引导组装**

SIN3A亚复合物模型包含SIN3A456-831（含SIN3APAH3和SIN3AHID结构域）、全长HDAC1、SAP30和SUDS3。整合建模产生了有效单一聚类（占总模型87%），模型精度为33 ?，97%的输入交联得到满足。结构显示SUDS3横跨复合物全长，另外三个蛋白集中在一端形成核心枢纽。核心枢纽包含SUDS3SID、SIN3APAH3、SIN3AHID、SAP30ZFD和SAP30SID等结构域，其中SIN3AHID形成包裹HDAC1的支架结构。SAP30ZFD、HDAC1和SUDS3SID大部分埋在枢纽内部。SIN3A通过与SUDS3和SAP30的多种相互作用来稳定SIN3A-HDAC1相互作用并正确定位HDAC1在核小体上的位置。

**4. CoREST复合物的交联引导组装**

CoREST亚复合物模型包含HDAC1、KDM1A和RCOR1。整合建模产生了有效单一聚类（占总模型69%），模型精度为12 ?，92%的输入交联得到满足，与EM图谱的交叉相关性为0.93。该亚复合物形成双叶结构，KDM1A占据上叶，HDAC1占据下叶，RCOR1-KDM1A复合物连接两叶。HDAC1与RCOR1的ELM2结构域（氨基酸105-160）发生相互作用，这与ELM2结构域介导HDAC招募的已知功能一致。RCOR1的ELM2-SANT1区域与HDAC1形成复合物的同时也与KDM1A的TOWER结构域相互作用。

**5. HDAC1内在无序CTD的建模**

AlphaFold3单独预测的二聚体和三聚体模型中，HDAC1的CTD仍保持高度无序状态。当采用XL-MS约束的整合结构建模方法后，在RCOR1:HDAC1、SIN3A:HDAC1、MBD3:HDAC1和MTA1:HDAC1四个二聚体模型中，HDAC1的CTD IDR均折叠为紧凑的α螺旋结构。然而，在二聚体模型中CTD与相互作用蛋白的接触有限。当构建HDAC1:MBD3:MTA1三聚体模型时，CTD折叠为有序的α螺旋结构并与MBD3和MTA1均产生接触，整体结构更加紧凑。对比分析表明，整合结构建模方法能完整建模折叠的HDAC1 CTD，而单独使用AlphaFold则无法实现。

**6. NuRD亚复合物中6个IDR的整合结构建模**

利用XL-MS数据中的47个独特分子内和分子间交联，研究人员构建了包含HDAC1:MBD3:MTA1:GATAD2B:RBBP4的NuRD亚复合物模型。除HDAC1 CTD IDR外，MBD3含有1个IDR（氨基酸254-291），MTA1含有2个IDR（氨基酸435-460和673-715），GATAD2B含有2个IDR（氨基酸62-123和213-235），共6个IDR。AlphaFold预测这些IDR区域内存在前结构基序（PreSMos），即瞬时的局部有序结构元件。整合模型显示，各蛋白的无序区域主要折叠为α螺旋结构系列。初始模型满足了87%的实验交联，剩余6个未满足交联被用于生成替代模型，两者的比较揭示了NuRD复合物内潜在的构象可变区域。

**总结与讨论**

本研究利用XL-MS和ISM构建了人类HDAC1/2相互作用组中NuRD、SIN3A和CoREST三个关键共抑制复合物的整合结构模型。通过分析这三种共抑制复合物的结构设计原则，研究人员归纳了共抑制复合物的四个通用组成要素：支架蛋白（NuRD中的MTA1、SIN3A中的SIN3A、CoREST中的RCOR1）、染色质修饰酶（去乙酰化酶和/或去甲基化酶）、DNA结合结构域及转录因子结合结构域。支架蛋白与HDAC的相互作用可分为紧密偶联（通过ELM-SANT结构域）和松散偶联（如SIN3A）两种模式。

HDAC1在与其他蛋白结合时表现出的构象差异，说明其CTD IDR在不同复合物环境中折叠成不同灵活性的α螺旋结构。与RCOR1结合时CTD呈现更灵活的构象，与SIN3A结合时则更刚性，而MBD3和MTA1则产生相似的结构效应。三聚体模型比二聚体模型更紧凑，强调了在结构建模中考虑多蛋白复合物的重要性。

**研究结论**

本研究结果强调了细胞环境在决定HDAC1构象中的重要性。HDAC1的结构可塑性受到不同蛋白质伙伴（如RCOR1、SIN3A、MBD3和MTA1）的影响，表明HDAC1功能受其相互作用网络的严格调控。HDAC1核心保守区域主要承担催化活性，而N端和C端区域的可变灵活性在调节与其他蛋白的相互作用中发挥关键作用。本研究同时强调了整合多个相互作用蛋白的HDAC1复杂结构模型的必要性，蛋白质-蛋白质相互作用对于将蛋白质稳定在与生物学功能相关的构象中至关重要。对HDAC1结构如何被不同复合物调控的理解，将为其在转录调控、染色质重塑和细胞信号传导等多方面功能提供重要见解。