基于质谱的N-糖基化轻链从头测序：连接尿液蛋白型与肾脏原位淀粉样沉积物

《Molecular & Cellular Proteomics》：Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing of N-Glycosylated Light Chains: Linking Urinary Proteoforms to In Situ Renal Amyloid Deposits

　　

摘要

系统性免疫球蛋白轻链（AL）淀粉样变性以克隆性免疫球蛋白分泌细胞为特征，这些细胞产生易于错误折叠并在组织中形成淀粉样纤维的单克隆轻链。理解其分子基础需要对淀粉样变性轻链进行精确的全长测序，并将循环轻链与肾脏沉积物相关联。实现这一目标具有技术挑战性，因为淀粉样变性轻链的低丰度和N-糖基化可能使蛋白质纯化和肽段水平序列分析复杂化。为应对这些挑战，研究人员实施了一个稳健的分析流程，该流程整合了Q-TOF质谱（Q-TOF MS）在去糖基化前后的完整分子质量测量、多蛋白酶消化和从头肽段测序，以系统地表征尿液来源的N-糖基化轻链。去糖基化前后观察到的质量偏移支持了N-糖基化的存在，而去糖基化后的完整分子质量被用于约束全长序列组装。随后将组装的尿液轻链序列与通过激光显微切割分离并经过自下而上液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的匹配肾脏淀粉样蛋白质组进行比较。酶促去糖基化减少了聚糖诱导的光谱干扰。从尿液轻链中组装出八条单克隆轻链序列，其中五条源自免疫球蛋白κ可变1（IGKV1），两条源自免疫球蛋白λ可变2（IGLV2），一条源自IGKV4。理论分子质量与实验完整分子质量的密切一致性确认了序列组装的准确性和完整性。在每个肾脏淀粉样蛋白质组中，相应的尿液来源序列在患者临床确定的同型（κ或λ）轻链鉴定中得分最高，并显示出87.6%-100%的可变区肽段覆盖率。总之，这些发现支持尿液N-糖基化单克隆轻链是相应肾脏淀粉样纤维的前体蛋白。总之，研究人员展示了一个稳健的工作流程，该流程应用既定的从头肽段测序技术来表征尿液N-糖基化轻链，并在肾脏淀粉样沉积物中追踪相应序列，具有在轻链相关疾病中的潜在应用价值。

**论文解读：基于质谱的N-糖基化轻链从头测序——连接尿液蛋白型与肾脏原位淀粉样沉积物**

**一、研究背景与科学问题**

系统性免疫球蛋白轻链（AL）淀粉样变性是最常见的系统性淀粉样变性类型之一，其病理特征在于克隆性浆细胞产生单克隆免疫球蛋白轻链（κ或λ型），这些轻链具有淀粉样变性倾向，错误折叠后组装为细胞外淀粉样纤维，进行性损害受累器官。轻链序列多样性源于可变区（V）和连接区（J）基因片段重组、V-J连接处连接多样性以及体细胞超突变，这使得淀粉样变性轻链序列具有高度患者特异性。结构上，轻链由N端可变结构域（VL）和C端恒定结构域（CL）组成，其中VL包含三个高度可变的互补决定区（CDR）和四个相对保守的框架区（FR）。轻链一级序列是决定其淀粉样变性的主要因素，FR或CDR区域的突变可能降低热力学稳定性、增加构象动力学、暴露聚集倾向区域或改变结构域间相互作用。

除序列异质性外，翻译后修饰（PTM），包括N端焦谷氨酸（PyroGlu）形成和N-糖基化，在AL淀粉样纤维中频繁观察到。基于患者来源的单克隆轻链分析表明，N-糖基化轻链在AL淀粉样变性中的检出频率高于其他浆细胞疾病，约见于14%-33%的κ轻链和2%-10%的λ轻链。在意义未明的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）患者中，N-糖基化单克隆轻链的存在与进展为AL淀粉样变性的风险增加相关。此外，N-糖基化AL淀粉样纤维对蛋白酶K消化的抵抗力强于去糖基化对应物。因此，确定这些N-糖基化轻链的全长氨基酸序列对于阐明N-糖基化在AL淀粉样变性中的致病意义至关重要。

尽管基于骨髓mRNA的cDNA末端快速扩增免疫球蛋白库测序（RACE-RepSeq）可以识别克隆性轻链序列，但该方法需要有创性骨髓穿刺，且通常仅提供VL和部分CL区域而非全长序列。此外，组织来源淀粉样纤维的从头测序受限于淀粉样变性轻链在沉积前的降解。在此背景下，尿液轻链的从头测序是一种非侵入性获取全长序列的方法，适用于肿瘤负荷较高的疾病如多发性骨髓瘤（MM）及其相关肾损伤。然而，孤立性AL淀粉样变性以低克隆浆细胞负荷和低循环游离轻链水平为特征，使得从外周体液中分离高纯度单克隆轻链变得困难，且N-糖基化进一步增加了分析难度。

**二、研究目的与研究内容**

本研究开发了一种整合的工作流程，结合分子质量约束的从头序列组装与组织蛋白质组学验证。该流程包括：通过Q-TOF质谱在去糖基化前后测量完整分子质量确认N-糖基化状态；利用七种蛋白酶进行多酶消化以生成互补肽段；基于去糖基化完整分子质量约束进行全长序列组装；通过激光显微切割结合自下而上液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对肾脏淀粉样沉积物进行蛋白质组学分析，验证尿液来源轻链序列与组织沉积物的一致性。

研究纳入北京大学第一医院经肾活检确诊的8例AL淀粉样变性患者（6例κ型、2例λ型），中位诊断年龄58.5岁（范围38-90岁），dFLC中位值160.8 mg/L。所有患者提供书面知情同意，研究符合《赫尔辛基宣言》并经伦理委员会批准。

**三、主要技术方法**

研究整合了多项关键技术：使用HiTrap KappaSelect或LambdaFabSelect亲和层析柱纯化尿液游离轻链，结合Protein G柱去除污染IgG和体积排阻色谱进一步纯化；采用电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱（ESI-Q-TOF MS）测量还原轻链去糖基化前后的完整分子质量；利用PNGase F酶促去糖基化消除聚糖干扰；采用七种蛋白酶（胰蛋白酶、Asp-N、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C+胰蛋白酶、弹性蛋白酶和猪笼草消化液）进行多酶消化；基于Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪采集LC-MS/MS数据，结合PEAKS Studio进行从头测序和数据库辅助搜索；使用novor.cloud平台进行序列验证；通过激光显微切割收集刚果红阳性肾淀粉样沉积物进行组织蛋白质组学分析；采用AlphaFold 3进行结构建模。

**四、研究结果**

**4.1 去糖基化后完整质量测量确认N-糖基化**

研究中测量到的糖基化轻链完整分子质量持续超出未糖基化λ（22,200-23,100 Da）和κ（23,100-24,600 Da）轻链的理论范围。酶促去糖基化后，完整分子质量下降约1,600-2,300 Da，与每个轻链含有一个N-糖基化位点一致。质量差异比较提示存在双天线复合型N-聚糖，且部分样本中相邻糖型间约203 Da（HexNAc）和291 Da（Neu5Ac）的质量差异证实了聚糖组成的异质性。

**4.2 全长序列组装与N-糖基化位点确定**

通过多酶消化结合从头肽段测序成功组装了8条单克隆轻链全长序列，包括5条IGKV1来源（1条IGKV1-16、2条IGKV1-33、2条IGKV1-39）、2条IGLV2-14和1条IGKV4-1。PNGase F处理显著改善了糖基化区域的肽段检测，去酰胺化肽段的出现精确填补了序列覆盖缺口。N-糖基化位点分布在FR1（PtH1-κ）、FR3（PtZ1-κ、PtZ2-κ）、FR4（PtL1-κ、PtC1-λ）、CDR1（PtB1-κ、PtB2-κ）和CDR3（PtT1-λ）等多个功能区域。

**4.3 组装的轻链序列综合验证**

完整的分子质量验证显示，所有组装序列的理论分子质量与实验测量值差异在±1 Da以内，确认了序列的完整性和组装准确性。肽段水平验证中，重建序列均以100%序列覆盖率被鉴定为最高得分匹配。对两个有骨髓样本储备的患者（PtC1-λ和PtZ2-κ）进行的RNA-based免疫球蛋白测序显示，质谱来源的VL和部分CL区域氨基酸序列与转录本来源序列100%一致。

**4.4 淀粉样变性轻链的氨基酸置换与N-糖基化位点**

VL结构域突变负荷为每条序列8-22个氨基酸置换。κ序列中28.6%的置换位于FR3，其次为FR2和CDR3（各17.9%）及CDR1（14.3%）。IMGT位置37（CDR1）是最常被置换的位置，共出现5次独立置换。两条λ轻链中，IMGT位置35（CDR1）、53（FR2）和123（FR4）均被置换。

**4.5 尿液来源轻链与肾淀粉样沉积物的序列一致性**

通过激光显微切割收集刚果红阳性淀粉样沉积物并经胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶平行消化后进行LC-MS/MS分析。7例患者中，尿液组装序列在任何工作流程中均排名第一。对于PtC1-λ，胰蛋白酶数据集中两种工作流程均识别出相应序列，而胰凝乳蛋白酶数据集中仅novor.cloud识别成功。全队列分析显示肾淀粉样沉积物中尿液组装轻链VL覆盖率为87.6%-100%，涵盖多个患者特异性突变残基。代表性MS/MS镜像图谱显示，跨越CDR1、CDR2和CDR3区域的肽段在尿液轻链和肾沉积物间具有高度相似的碎片离子模式。N-糖基化位点在肾沉积物中经PNGase F处理后均以去酰胺化Asn形式被鉴定，支持N-糖基化轻链参与淀粉样纤维形成。

**4.6 从头测序轻链及其N-糖基化位点的结构作图**

AlphaFold 3结构建模显示，PtB1-κ的CDR1环中Ser-to-Asn置换在Asn28处产生NIS N-糖基化序列基序，PtZ2-κ的FR3β-折叠链中Ser-to-Asn置换在Asn65处产生NGS序列基序。含N-乙酰葡糖胺（NAG）模型与无糖模型比较显示整体折叠相似（PtB1-κ RMSD 1.30 ?，TM-score 0.95；PtZ2-κ RMSD 0.52 ?，TM-score 0.99），但PtB1-κ的结构差异较大，可能与其糖基化位点位于构象柔性CDR1环有关。PtZ2-κ模型中NAG与Arg18形成3.0 ?极性接触，提示存在局部聚糖-蛋白质相互作用。

**五、讨论与结论**

本研究利用从头肽段测序成功从常规临床标本中表征了患者特异性轻链序列和N-糖基化位点，并通过肾脏淀粉样沉积物蛋白质组学验证了相应的尿液轻链是肾淀粉样形成的前体蛋白。与以往仅针对组织提取淀粉样纤维的从头测序不同，该方法为AL淀粉样变性中循环轻链与组织沉积物的关联提供了实用平台。研究明确了预测的N-糖基化序列基序确实被聚糖占据，且N-糖基化轻链被整合入组织淀粉样纤维中，为国际骨髓瘤工作组质谱委员会强调的N-糖基化作用机制问题提供了研究框架。

研究存在技术局限：肾淀粉样样本的VL覆盖率因沉积物丰度不同而异，稀疏沉积物中低丰度轻链肽段和角蛋白污染限制了肽段检出；从头测序无法明确区分亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile），仅能根据酶切偏好推断。结论上，该整合工作流程通过在AL淀粉样变性中组装全长淀粉样变性轻链序列，与匹配肾淀粉样沉积物的序列一致性支持尿液轻链分析作为骨髓穿刺获取淀粉样变性轻链序列的非侵入性替代方法，且实现了对N-糖基化轻链的测序，为淀粉样变性轻链及其他轻链相关疾病的机制研究提供了实用框架。质谱蛋白质组学数据已存储于ProteomeXchange Consortium（iProX数据库，PXD077287）。