一种基于四个基因的铜死亡（cuproptosis）mRNA的多通道电化学传感阵列，用于外周动脉疾病中动脉粥样硬化斑块的分子亚型分型

《Microchemical Journal》：A four-gene cuproptosis mRNA multi-channel electrochemical sensing array for molecular subtyping of atherosclerotic plaques in peripheral artery disease

　　我们开发了一种四通道电化学核酸阵列，可以直接读取铜死亡相关的转录组分类。随后，我们设计了一种含有四个金工作电极（W1-W4）的芯片。甲烯蓝氧化还原报告基因将每个电极上的杂交反应转换为差分脉冲伏安电流。

### 引言
电化学传感器是一种基于电极表面电活性物质氧化还原反应产生的电信号与分析物浓度之间的定量关系构建的体外检测技术。由于具有高灵敏度、低检测成本、快速分析速度以及易于微型化和集成等优点，它们在心血管疾病生物标志物检测领域得到了广泛研究和应用。在动脉粥样硬化和外周动脉疾病的检测场景中，通过带有抗体、核酸适配体和肽等识别元件的改性工作电极，电化学传感器能够对血清、血浆和血管组织样本中的炎症因子、脂质代谢物、功能蛋白和核酸生物标志物进行定量检测。现有研究已经开发出多种用于检测动脉粥样硬化经典生物标志物的电化学方法，包括用于高灵敏度C反应蛋白的阻抗型免疫传感器、用于脂蛋白相关磷脂酶A2的电流型传感器以及用于循环microRNA的电化学DNA传感器。一些技术已经完成了验证研究，并显示出补充传统酶联免疫吸附测定法和聚合酶链反应的潜力。对于与动脉粥样硬化斑块进展相关的大分子生物标志物（如三羧酸循环的关键酶和细胞表型转换相关蛋白），通过修改电极材料（如碳纳米管、金属有机框架和纳米金），电化学传感器可以提高信号响应强度和识别元件的固定效率，从而实现对低丰度样本的准确定量。其中，作为细胞能量代谢核心调节分子的丙酮酸脱氢酶复合物组分PDHA1的蛋白活性和表达水平已在肿瘤和代谢疾病领域进行了研究，通常采用酶促反应介导的电流信号放大策略来实现定量蛋白活性。然而，在动脉粥样硬化背景下，针对PDHA1和铜死亡途径相关分子的电化学检测方法仍然相对较少，而且大多数现有的心血管电化学传感方案都是围绕单一生物标志物设计的，这使得难以反映疾病的分子异质性。

外周动脉疾病影响着全球超过2.3亿成年人，仍然是系统性动脉粥样硬化中最未得到充分治疗的病症之一[1]。尤其是下肢疾病，特别是股腘动脉和腘下动脉病变，具有较高的重大不良肢体事件和截肢风险[2]。除了抗血小板药物、他汀类药物和抗凝药物外，可用的药物治疗选择有限，从冠状动脉或颈动脉领域推断疗效的试验在外周动脉疾病中的效果常常不佳[3],[4]。一个合理的解释是，下肢动脉粥样硬化在生物学上具有异质性，一刀切的方法掩盖了治疗响应的亚组。

铜死亡（cuproptosis）由Tsvetkov及其同事在2022年定义，是一种由铜诱导的细胞死亡形式，其机制依赖于TCA循环中脂酰化蛋白（特别是DLAT）的聚集，以及FDX1、LIAS、LIPT1和DLD支持的铁-硫簇的完整性[5]。除了在癌症生物学中的作用外，铜的代谢还涉及血管钙化、内皮激活、平滑肌表型转换和巨噬细胞极化，所有这些因素都会导致斑块不稳定[6],[7]。平滑肌去分化和平滑肌向间充质转化被认为是不稳定表型的驱动因素，但通过转录组评分捕获的铜死亡活性是否能在多个动脉粥样硬化队列中区分出具有临床意义的亚组尚未进行过并行研究[8],[9]。外周动脉斑块的生物学特征存在显著个体差异，统一的治疗方案难以满足所有患者的治疗需求。使用多标志物组合进行分子分型是实现个性化治疗的核心前提。电化学多通道传感器阵列可以在同一芯片上同时检测多个目标分子的表达水平，通过信号模式识别完成样本的分子亚型分类，并准确满足外周动脉疾病异质性评估的检测要求。本研究重点关注与铜死亡相关基因相关的外周动脉疾病斑块的分子亚型鉴定，筛选出具有分类价值的核心生物标志物，为后续开发靶向电化学传感检测系统提供明确的目标组合和分类参考，促进分子分型结果从研究场景向临床检测场景的转化。我们通过将三个批量微阵列系列和一个单细胞颈动脉数据集整合到单一分析流程中来解决这一差距。首先，我们探讨了铜死亡是否随颈动脉床斑块的进展而变化，这里有早期与晚期、完整与动脉粥样硬化的匹配对比数据。然后，我们将该评分应用于股动脉和腘下动脉队列，应用无监督的CRG基础亚型分类方法，并从通路、免疫浸润和血管病理维度对结果组进行特征描述。中心CRG层用于将亚型身份投影到定制的药物-靶标表中，并探讨候选药物类别是否能通过其中心靶标的平均z表达量来区分不同亚型。单细胞数据用于验证哪些细胞组分贡献了总体铜死亡信号。

### 生物信息学识别候选铜死亡靶标（发现依据）
传感阵列所检测的四个分子靶标是通过先前的转录组分析确定的，这里总结为发现依据。从基因表达组（Gene Expression Omnibus）中检索了三个公共的动脉粥样硬化队列（GSE28829颈动脉、GSE43292颈动脉、GSE100927下肢）和一个单细胞数据集（GSE159677），并将它们简化为基因符号。对每个样本使用单样本基因集富集方法对一个精心策划的18个基因铜死亡相关基因（CRG）面板进行评分。

### 四通道铜死亡mRNA传感阵列
为了将转录组亚型转化为可部署的读数，我们设计了一种包含四个金工作电极（W1-W4）的芯片阵列，每个电极都携带一个巯基化捕获探针，分别针对CDKN2A（W1）、GLS（W2）、GCSH（W3）和PDHA1（W4），共享一个Ag/AgCl参比电极和一个铂对照电极（图1）。逆转录的细胞系RNA在芯片上杂交，MB氧化还原报告基因将每个电极上的杂交反应转换为DPV电流，因此每个样本都被编码为一个信号。

### 讨论
本研究将外周动脉疾病的电化学检测从单一标志物传感转变为多路复用、能分辨亚型的阵列。单个芯片并行读取四种铜死亡核心mRNA，并将其模式转换为化学计量学亚型分类，因此输出是一个分子类别（CuS_A或CuS_B），而不仅仅是一个孤立浓度。据我们所知，这是首个结合铜死亡转录组分类的电化学设计。

### 结论
电化学多通道传感为外周动脉疾病的精准分层诊断提供了实用途径。在这项研究中，利用下肢PAD动脉粥样硬化的转录组铜死亡分类（两种可复制的亚型CuS_A、CuS_B，受四个核心基因（CDKN2A、GLS、GCSH、PDHA1）调控），设计了一种四个工作电极的核酸阵列，将单个细胞衍生的RNA样本转换为四维电流指纹图谱，并通过化学计量学方法进行分析。

### 数据和代码可用性
所有四个数据集均通过基因表达组（Gene Expression Omnibus）公开提供，访问号为GSE28829、GSE43292、GSE100927和GSE159677。

### 作者贡献声明
Zimian Gao：撰写——原始草案、方法学设计。
Jihang Zheng：研究、概念化。
Weibiao Chen：撰写——审阅与编辑、软件实现。
Hao Pan：验证、资金申请。

### 资金支持
本工作未接受任何外部资助。

### 引用文献
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### 利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

### 致谢
作者感谢GSE28829、GSE43292、GSE100927和GSE159677的原始研究者使其数据能够公开获取。

Zimian Gao | Jihang Zheng | Weibiao Chen | Hao Pan