《Microchemical Journal》：Using electrochemical immunosensors to analyze the diagnosis of lung adenocarcinoma: LUAD hub genes to a GOLM1/ANGPTL7 immunosensor
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•这项工作通过开发了一种安培免疫传感器，解决了检测两种循环肺癌相关蛋白（GOLM1和ANGPTL7）的难题。•通过分阶段的转录组筛选和bulk TCGA分析，结合单细胞图谱来研究细胞的起源。•在四种癌细胞系和支气管对照组中进行的RT-qPCR和ELISA实验验证了这些结果。引言肺
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这项工作通过开发了一种安培免疫传感器，解决了检测两种循环肺癌相关蛋白（GOLM1和ANGPTL7）的难题。
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通过分阶段的转录组筛选和bulk TCGA分析，结合单细胞图谱来研究细胞的起源。
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在四种癌细胞系和支气管对照组中进行的RT-qPCR和ELISA实验验证了这些结果。
引言
肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，最新统计数据显示每年新增病例约250万例，死亡病例约180万例[1]。目前，腺癌是大多数国家中最常见的肺癌类型，它具有独特的驱动突变、生长模式和治疗方案，不能简单地归类为非小细胞肿瘤[2]。对大规模肺癌样本的分子分析揭示了*EGFR*、*KRAS*、*TP53*和*STK11*等基因的反复变异，并将肺癌分为不同的转录亚组[3]；这些发现为酪氨酸激酶抑制剂、KRAS靶向药物和免疫检查点阻断疗法提供了理论依据[4],[5]。然而，大多数患者就诊时已处于疾病晚期，且容易产生耐药性，转移性肺癌患者的五年生存率仍然很低。虽然bulk转录组研究产生了许多预后基因候选列表，但由于肿瘤、基质细胞和免疫细胞的混合影响，无法准确确定信号的来源及其在组织中的位置。单细胞RNA测序技术能够解析出不同细胞类型的表达情况，揭示了肺癌微环境的细胞组成[6]；而空间转录组学技术则保留了每个测量的组织坐标，展示了不同区域内的表达模式[7],[8]。结合使用这两种方法，可以提供bulk数据无法提供的细胞和空间背景信息。
尽管已发表了大量的肺癌相关基因特征数据，但仍存在三个主要问题：许多基因列表仅基于bulk数据得出，很少有数据经过与产生信号的具体细胞类型和组织的验证，更少的数据在实验室内得到独立验证[9],[10]。我们的研究设计旨在克服这些局限。TCGA分析及其后续的单细胞和空间特性研究不仅用于基因排序，还旨在寻找可实际用于临床检测的标志物。在十个候选基因中，只有GOLM1和ANGPTL7是从细胞中直接释放出来的，因此可以直接从上清液中取样进行检测，无需进行细胞裂解。我们将这两个基因纳入电极检测方法中，能够在几分钟内获得每种蛋白的定量结果，将组学分析视为实现临床应用的途径而非终点。
选择GOLM1和ANGPTL7作为检测目标是基于多个综合标准，而不仅仅是它们的分泌特性。首先，这两种蛋白都能通过非经典途径从高尔基体释放出去（GOLM1通过外泌体途径，ANGPTL7通过典型的分泌途径）；其次，它们在肺癌中的表达变化方向相反（GOLM1升高，ANGPTL7降低），这成为内在的质量控制手段——有效的检测结果应显示这两个标志物的变化一致，从而降低单一标志物检测的假阳性风险。此外，这两个基因同时满足所有三个组学分析的要求：在TCGA-LUAD样本中的表达变化幅度（|log?FC|）大于1，与总体生存率显著相关（p<0.05），并且在四种肺癌细胞系中的RT-qPCR和ELISA实验中均保持一致的变化方向。在其余八个候选基因中，FENDRR是无蛋白产物的非编码RNA，而FAM83A、PAICS、PPP1R14B、ATIC、GRIA1、SGCG和CD300LG均为细胞内蛋白（位于细胞质、细胞核或膜上），无法在不破坏细胞的情况下用无标记免疫传感器进行检测。
当某个基因特征能够在非测序环境中快速、低成本地被检测到时，其价值最大。然而，本文使用的验证方法（RT-qPCR和ELISA）仍依赖于实验室条件，操作繁琐且耗时，限制了其在即时检测或患者附近应用的普及。电化学免疫传感器解决了这一问题：它们能将抗体-抗原结合事件直接转化为电极界面处的电流、电位或阻抗信号，具有高灵敏度和低成本，无需复杂的光学系统，且易于微型化和多路复用。十个候选基因中有两种是可分泌到细胞外的蛋白（GOLM1和ANGPTL7），因此无需进行细胞裂解即可检测。由于它们在肺癌细胞中的表达变化方向相反，因此它们构成了理想的双指标检测组合。本文的主要创新在于开发了一种针对GOLM1和ANGPTL7的电化学免疫传感器，将这两个候选基因转化为实用的定量检测工具，并使用相同的细胞上清液样本进行验证。
章节摘要
数据来源与预处理
本研究使用了三个公共数据集：TCGA-LUAD项目的bulk RNA测序数据及对应的临床记录，数据以log2变换后的FPKM值形式提供，包括512个原发肿瘤样本（后缀01A）和57个正常肺组织样本（后缀11A），共有59,427个基因标识符[3]。单细胞数据来自GSE200916研究，该研究分析了3名患者12个样本的细胞组成和空间结构
肺癌与正常肺组织之间的差异表达
经过低表达过滤后，对512个肿瘤样本和57个正常肺组织样本进行了差异表达分析。当表达变化幅度（|log2 fold change|）大于1且p值小于0.05时，有1971个基因表现出显著差异（1971个基因上调，1054个基因下调）；火山图（图1A）展示了这种差异，热图（图1C）进一步突出了其中50个最显著的基因。对这些基因进行单变量Cox回归分析后，有733个基因的p值小于0.05（其中394个基因通过了Benjamini-Hochberg校正）
讨论
单独看，这十个基因的列表本身就是一个发现成果；但在实际应用中，它们是从中筛选出的潜在检测目标。每个基因都必须同时满足三个条件：在肿瘤组织和正常组织中的表达差异、与生存率的关联，以及在多种分析平台上的稳定性。最终筛选出的十个基因在肿瘤组织和培养细胞中的表达趋势保持一致：其中五个基因在两种样本中的表达均上升，五个基因表达均下降；九个基因的蛋白质数据也一致；表达上升的基因主要集中在上皮细胞中
结论
这项组学研究的价值在于它指出了可测量的生物学指标。虽然从筛查中发现了十个候选基因，但只有GOLM1表达升高、ANGPTL7表达下降这两个基因实际是从细胞中释放出来的，这一特性使得临床检测成为可能。构建基于这两个基因的双通道检测系统后，每个标志物的结果都能相互验证，只有当两者都符合预期变化时，检测结果才具有可靠性。最初作为肿瘤基因列表开始的这一过程，最终形成了一个实用的临床检测工具。
CRediT作者贡献声明
Zhuqing Ji： 负责撰写初稿和资源整理。Xiu Zhang： 负责项目管理和资金申请。Hui Ding： 负责数据分析与概念设计。Zhongneng Xu： 负责撰写、审稿与软件开发。Long Qian： 负责资源协调与实验设计。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知利益冲突或个人关系。
Zhuqing Ji|Xiu Zhang|Hui Ding|Zhongneng Xu|Long Qian
