《Nano Trends》：PBA-Modified α-cyano-4-hydroxycinnamate and Gefitinib Liposomes for Macrophage Metabolic Reprogramming to Boost Antitumor Immunity
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双脂质体系统可降低肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的乳酸水平，从而重编程肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）并激活抗肿瘤免疫。研究人员通过一种新型成盐方法制备了高载药量的
双脂质体系统可降低肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的乳酸水平，从而重编程肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）并激活抗肿瘤免疫。研究人员通过一种新型成盐方法制备了高载药量的吉非替尼脂质体（gefitinib liposomes, GFB-LIP）。苯硼酸（phenylboronic acid, PBA）修饰的α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamate, CHC）脂质体（PBA-CHC-LIP）能够特异性靶向4T1肿瘤细胞。
**PBA修饰的α-氰基-4-羟基肉桂酸与吉非替尼脂质体协同重编程巨噬细胞代谢以增强抗肿瘤免疫——论文解读**
**一、研究背景与问题**
肿瘤细胞即使在有氧环境中也优先通过糖酵解产生并释放乳酸，形成酸性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。近年研究揭示，乳酸不仅是代谢废物，更是肿瘤免疫抑制的重要驱动因素。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）作为抗肿瘤免疫的关键效应细胞，其M1/M2亚型平衡直接影响肿瘤进展。高乳酸微环境可诱导巨噬细胞由M1型向M2型极化——乳酸被TAMs摄取后转化为丙酮酸，进入三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环生成乙酰辅酶A，通过蛋白质乙酰化依赖性基因表达增强M2型基因表达。因此，降低微环境乳酸水平有望促进M1型极化并激活肿瘤免疫治疗。
单羧酸转运体（monocarboxylate transporters, MCTs）介导乳酸跨膜转运，MCT1和MCT4在多种恶性肿瘤细胞中高表达并主导乳酸外排。α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamate, CHC）是经典的MCT1/4抑制剂，但缺乏肿瘤组织靶向性，限制了其体内疗效。另一方面，吉非替尼（gefitinib, GFB）作为表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，水溶性差、口服生物利用度低，肿瘤组织浓度不足。脂质体可通过增强渗透滞留（enhanced permeability and retention, EPR）效应和靶向分子修饰实现药物精准递送，有望解决上述问题。
**二、研究内容与总体结论**
研究人员构建了苯硼酸（phenylboronic acid, PBA）修饰的CHC脂质体（PBA-CHC-LIP）和高载药量GFB脂质体（GFB-LIP）。体外及体内实验表明：PBA-CHC-LIP通过PBA与肿瘤细胞表面唾液酸特异性结合增强靶向摄取，有效抑制4T1细胞乳酸外排；GFB-LIP通过成盐方法提高药物水溶性，诱导4T1细胞凋亡并减少乳酸产生。两脂质体联合治疗显著降低肿瘤微环境乳酸浓度，抑制M2-TAM极化，同时促进M1-TAM极化，增强CD8?T细胞浸润并减少调节性T细胞和髓源性抑制细胞，从而激活抗肿瘤免疫。该研究发表于《Nano Trends》，为巨噬细胞代谢重编程治疗提供了新策略。
**三、主要技术方法**
研究采用薄膜分散法制备PBA-CHC-LIP，通过酰胺化反应合成DSPE-PEG2000-PBA靶向脂质；采用新型成盐方法制备吉非替尼乳酸盐（GFB-LA），结合硫酸铵梯度主动载药法制备高载药量GFB-LIP。表征手段包括动态光散射、透射电镜、核磁共振氢谱、傅里叶变换红外光谱、差示扫描量热法、X射线衍射及扫描电镜。细胞实验采用CCK-8法、流式细胞术、激光共聚焦显微镜、乳酸检测试剂盒、丙酮酸及乙酰辅酶A检测试剂盒、qPCR和ELISA。体内实验采用4T1荷瘤BALB/c小鼠模型（小鼠由沈阳长生生物科技有限公司提供；4T1和RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库），通过小动物活体成像、免疫荧光、H&E染色和TUNEL染色评价分布与疗效。
**四、研究结果**
**2.1 CHC通过减少4T1乳酸外排重编程代谢以调控巨噬细胞极化**
将RAW264.7细胞与乳酸共培养后，CD206表达升高，丙酮酸和乙酰辅酶A水平增加，表明乳酸直接促进巨噬细胞由M0向M2转化。用CHC抑制MCT1/4后，M1标志物（IL-12、iNOS、TNF-α）显著上调，M2标志物（IL-10、Arg-1、TGF-β1）显著下调，证实降低乳酸外排可逆转M2极化。
**2.2 PBA-CHC-LIP的制备与表征**
通过酰胺化反应成功合成DSPE-PEG2000-PBA，采用薄膜分散法制备PBA-CHC-LIP，粒径为92.90±1.68 nm，PDI为0.175±0.003，载药量4.4±1.33%，包封率63.7±0.98%。体外释放实验显示其具有明显缓释特性，48小时累积释放约40%，稀释及储存稳定性良好，符合静脉给药要求。
**2.3 PBA-CHC-LIP被4T1有效摄取并抑制乳酸外排**
游离唾液酸竞争实验证实，PBA修饰通过特异性结合4T1细胞表面唾液酸增强脂质体内化。在25 μg/mL浓度下，PBA-CHC-LIP使细胞外乳酸水平降低约75%，且细胞存活率保持在80%以上，证明其通过直接阻断MCT1/4介导的乳酸外排发挥高效作用。
**2.4 高载药量GFB-LIP的制备**
将GFB与乳酸以1:3摩尔比在去离子水中反应制成GFB-LA，经XRD和DSC证实形成无定形态，显著提高水溶性。采用硫酸铵梯度主动载药法制备GFB-LIP，载药量5.3±1.32%，包封率94±1.49%。透析48小时完全去除游离乳酸。粒径126.70±0.86 nm，体外48小时累积释放40%，具备缓释和稳定性。
**2.5 GFB-LIP促进4T1凋亡并减少乳酸产生**
GFB-LIP以时间和浓度依赖性方式抑制4T1细胞增殖。在15 μg/mL时，早期凋亡率为21.4%，晚期凋亡率为17.5%。同时，细胞外乳酸浓度随浓度增加而降低，15 μg/mL时减少45.12%，与诱导凋亡的效应一致。
**2.6 PBA-CHC-LIP联合GFB-LIP体外抑制M2-TAM极化**
联合用药组的早期凋亡率（35.8%）和晚期凋亡率（15.3%）显著高于GFB-LIP单药组，细胞外乳酸含量进一步降低。将处理后4T1条件培养基与巨噬细胞共培养，发现丙酮酸和乙酰辅酶A水平显著下降，CD206表达降低，M1标志物上调、M2标志物下调，证明联合治疗在体外有效重编程巨噬细胞代谢并抑制M2极化。
**2.7 联合疗法抑制4T1荷瘤小鼠肿瘤进展**
活体成像显示PBA-CHC-LIP和GFB-LIP均可在肿瘤组织富集，PBA修饰显著增强CHC-LIP的肿瘤靶向性。经过3次静脉注射治疗，联合治疗组肿瘤体积和肿瘤重量均为各组最低，H&E染色显示细胞核破碎固缩，TUNEL荧光强度最强，且各治疗组小鼠体重、主要器官重量及H&E染色未见明显异常，表明联合疗法具备良好安全性。
**2.8 联合疗法降低体内乳酸并激活抗肿瘤免疫**
联合治疗组肿瘤组织乳酸水平显著低于其他组。CD206表达明显下降，M1型标志物（IL-12、TNF-α、iNOS）在基因和蛋白水平均升高，M2型标志物（IL-10、TGF-β1、Arg-1）降低。免疫荧光检测发现CD3?CD8?T细胞比例增加，而CD4?Foxp3?调节性T细胞和CD11b?Gr-1?髓源性抑制细胞显著减少，说明联合疗法重塑了肿瘤免疫微环境。
**五、总结与讨论**
研究人员证实，PBA-CHC-LIP与GFB-LIP协同降低肿瘤微环境乳酸水平，通过抑制TCA循环相关代谢通量，减少乙酰辅酶A生成，从而抑制M2-TAM极化并促进M1-TAM极化，解除免疫抑制。该研究通过“直接杀伤肿瘤细胞+间接代谢重编程免疫细胞”的双重策略，为基于乳酸代谢调控的肿瘤免疫治疗提供了新思路。
**研究结论翻译**：总之，本研究表明CHC可通过减少乳酸外排抑制M2-TAM极化。PBA-CHC-LIP体系对肿瘤细胞具有特异性靶向能力，实现了CHC的高效递送。本研究中高载药量GFB脂质体在促进4T1细胞凋亡的同时减少乳酸产生。PBA-CHC-LIP与GFB-LIP联合治疗显著降低了肿瘤微环境中的乳酸水平，从而实现巨噬细胞代谢重编程，减少M2-TAM群体以增强抗肿瘤免疫。本研究强调了高乳酸肿瘤微环境对巨噬细胞代谢的深远影响。所提出的协同治疗策略整合了直接肿瘤细胞毒性与间接免疫细胞代谢重编程，具有重要的临床转化前景。
