从Porphyridium cruentum中提取的多糖过硫化现象：其特性及其对抗疱疹病毒的抗病毒活性

《Polymer》：Over-sulfation of polysaccharides derived from Porphyridium cruentum: Characterization and antiviral activity against Herpes viruses

　　

摘要

来自红色微藻Porphyridium cruentum的细胞外多糖具有对抗疱疹病毒的抗病毒活性，但其硫酸盐含量如何影响抗病毒效果和物理化学性质目前尚不清楚。在本研究中，我们使用三氧化硫-吡啶方法增加了P. cruentum衍生多糖的硫酸盐含量，过程中有或没有加入硼氢化钠（NaBH₄）预处理，并评估了其对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和水痘-带状疱疹病毒（VZV）的细胞毒性、物理化学变化及抗病毒活性。硫酸化处理1-3小时后，硫酸盐含量从约5 wt%（原始状态）提高到约14-23 wt%，且未增加Vero细胞的细胞毒性；经过NaBH₄预处理的硫酸化多糖在10 μg/mL浓度下可达到100%的HSV-1抑制效果。相比之下，长时间硫酸化处理（7小时）无论是否添加NaBH₄，都会降低多糖的抗病毒活性。FTIR光谱和ζ电位测量证实了硫酸盐的引入，扫描电子显微镜（SEM）和流变学分析显示了形态和流变学的变化，包括黏度显著降低。这些发现表明需要优化硫酸化条件以增强P. cruentum衍生多糖的体外抗病毒活性，并为物理化学变化与抗病毒功能之间的关联提供了依据。

引言

Porphyridium cruentum是一种被广泛研究的红色微藻，它能分泌一种水溶性的硫酸化多糖（简称P.cr），该多糖具有独特的物理化学性质，能够在相对较低的聚合物浓度下形成高黏度溶液，类似于黄原胶和卡拉胶等工业多糖[1]、[2]。这种多糖是一种阴离子高分子量生物聚合物（平均约2.3×10³ kDa，分布范围较广），由于其复杂性及特定降解酶的缺乏，其详细结构尚未完全解析[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。结构研究表明，其链结构有序且相对刚性，具有取向明显的双螺旋排列，螺距为1.6 nm（即一个单链中有两个化学重复单元）[6]、[7]。其链的刚性与黄原胶和DNA等刚性螺旋相当[6]。与此结构一致，P.cr表现出典型的非牛顿流变行为，包括剪切稀化、触变性和弹性[6]、[7]。

从功能上看，Porphyridium衍生多糖在各种现有和潜在的应用领域中具有广泛用途，从增稠和凝胶化到生物材料应用以及生物活性制剂[1]、[2]、[8]。特别是这些多糖对疱疹病毒的生物活性已被充分证实：来自Porphyridium属的 soluble polysaccharides 在体外和体内均能以剂量依赖的方式抑制单纯疱疹病毒（HSV-1/2）和水痘-带状疱疹病毒（VZV）[9]、[10]、[11]、[12]，为设计和研究抗病毒衍生物提供了良好的平台。事实上，硫酸化多糖具有抗病毒活性是众所周知的现象，这一效果主要是通过多阴离子聚合物与病毒包膜糖蛋白上的正电荷位点之间的静电相互作用实现的，从而干扰病毒的早期感染阶段[10]、[11]、[13]、[14]、[15]、[16]。通常认为增加硫酸盐含量可以增强硫酸化多糖的抗病毒活性，但目前主要采用化学硫酸化方法来实现这一目的[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]，但这种方法会改变聚合物的性质（如电荷密度和流变行为），反而可能降低而非增强其生物活性[28]。因此，寻求非化学方法来增加硫酸化多糖（包括P.cr）的硫酸盐含量可能更为合适。此外，P.cr的硫酸盐含量对其抗病毒效果的影响尚不完全清楚[1]、[2]：系统性的研究将特定的硫酸化条件与物理化学变化和抗病毒效果联系起来仍不多见，尽管早期研究表明增加Porphyridium衍生多糖的硫酸盐含量会带来某些生物效应，但硫酸化条件、多糖性质与生物活性之间的详细关联尚未确立[1]、[2]、[29]。

在本研究中，我们使用三氧化硫-吡啶方法对P. cruentum培养基中提取的可溶性多糖进行了化学硫酸化处理，并测试了反应时间对硫酸盐含量、物理化学性质及P.cr对抗HSV-1和VZV的抗病毒活性的影响。作为对照，我们还研究了卡帕卡拉胶（以下简称K）：这是一种高度硫酸化的红藻多糖，已证实具有抗病毒活性[30]。同时，我们探讨了硼氢化钠（NaBH₄）预处理对P.cr性质的影响。我们假设预处理可以保护多糖链的还原末端免受三氧化硫-吡啶硫酸化过程中产生的三乙胺和吡啶引起的碱性催化降解作用[31]、[32]、[33]。在硫酸化过程中，这些胺类作为质子受体，中和了多糖被亲核攻击时释放的氢离子。然而，它们的碱性也使其能够攻击多糖上未受保护的开放链末端醛基，引发一系列异构化和β-消除反应，从而逐步从还原末端断裂单体单元。我们预期硼氢化钠会将易受攻击的末端醛基转化为稳定的非还原性醇类；通过消除末端活性羰基，这种结构转变可以完全阻断碱催化的降解反应，有效保持聚合物链的分子量。由于硼氢化钠具有还原性，我们预计它还会将醛基和酮基转化为醇类（图1A），从而阻止这些反应的起始。硫酸化反应涉及羟基对三氧化硫的亲核攻击（图1B）[19]、[20]、[34]。

通过结合硫酸盐含量测定、电荷（ζ电位）、化学/结构特性（FTIR、SEM-EDX、TGA）和流变学测量，我们找到了能够增强抗病毒活性的最佳硫酸化条件，并指出过度硫酸化会降低抗病毒效果，强调在提高硫酸盐含量的同时需保持聚合物关键性质的平衡。

章节摘录

多糖制备

P. cruentum（UTEX 631；原产于瑞士巴塞尔）在圆柱形聚苯乙烯气升式反应器中培养（直径10厘米，高度3.5米，操作体积10升），初始接种量为0.2克/升藻细胞。培养基由人工海水（ASW；盐度17 ppt）组成，添加了F/2微量元素、氮源NaNO₃（0.6克/升）和磷源NaH₂PO₄（0.1克/升）。反应器在16/8小时的光照周期下运行，使用冷白光

硫酸盐含量和电荷分布

我们测定了从P. cruentum培养基和卡帕卡拉胶（分别简称为P.cr和K）中分离出的多糖在原始状态（对照组）以及经过三氧化硫-吡啶方法化学硫酸化处理后的硫酸盐含量，处理过程中使用了不同的反应时间，在某些情况下还进行了8小时的硼氢化钠预处理。表1展示了硫酸化处理前后两种多糖的硫酸盐含量。

结论

我们研究了使用三氧化硫-吡啶复合物对P. cruentum衍生多糖进行过度硫酸化对其物理化学性质和抗病毒效果的影响。无论是否添加硼氢化钠预处理，延长硫酸化反应时间都会增加多糖的硫酸盐含量，但即使浓度高达1000 μg/mL，也不会增加其对Vero细胞的毒性。总体而言，P.cr的硫酸盐含量与其抗病毒活性呈正相关

CRediT作者贡献声明

Nof Karshan：方法学研究、数据分析。Mahmoud Huliehel：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、概念构思。oshrat Levy-ontman：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源协调、研究资助、数据分析、概念构思

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

Nof Karshan|Mahmoud Huliehel|Oshrat Levy-Ontman

以色列Beer-Sheva Shamoon工程学院化学与绿色工程系，邮编8410802