pIE545的完整序列，即原始的Z型质粒

《Plasmid》：Complete sequence of pIE545, the original Z-type plasmid

　　

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  报道了历史悠久的Z型质粒pIE545的完整序列。
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  pIE545完善了I复合质粒组的序列。
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  pIE545由86.7 kb的骨架和20 kb的辅助区域组成。
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  Z型复制子和shufflon与其他I复合质粒的不同。
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  骨架中的impB基因被一个新的整合元件IE-545打断。

引言

conjugative质粒是水平基因转移的主要驱动力，通常会导致重要细菌病原体中抗生素抗性的传播。准确追踪质粒的传播需要对那些随时间改变其结构和序列特征的进化力量有深刻的理解。同时，现代基因组研究也应基于历史上形成的实验数据，这些数据帮助我们理解质粒生物学。

多种过程驱动着质粒的进化。对质粒结构影响最显著的是可移动元件（TEs），如插入序列（IS）、转座子和整合元件（IEs），它们可以插入质粒骨架中（Partridge等人，2018；Blackwell等人，2021；Ambrose等人，2018）。一个或多个TEs插入质粒骨架后会增加其基因库，从而增大质粒大小。一旦存在，某些TEs可以移除或倒置骨架片段，或者成为其他元件的目标，导致结构变得越来越复杂（Ambrose等人，2018；Hu等人，2022；Cain和Hall，2012；Moran等人，2024；Reid等人，2015）。同源重组对质粒骨架的影响可能较为微妙，只改变等位基因而不影响基因内容（Osborn等人，2000）。然而，重组事件也可以将新的物质引入质粒，例如在肠杆菌目中的F型质粒（He等人，2013；Moran等人，2016）和广宿主范围的IncC质粒（Ambrose等人，2018）中观察到的那样。最终，同源重组事件有可能产生具有混合特性的新质粒谱系。

Z型质粒是一类属于I复合体的conjugative质粒。I复合体包括I1、I2、B/O、K和Z型质粒，最初的分类是基于这些质粒对特定噬菌体的敏感性（Meynell和Lawn，1968；Coetzee等人，1980），后来则通过它们编码的conjugative菌毛的形态学和血清学特性进行了进一步定义（Bradley，1980；Bradley，1984）。目前已有四种基础质粒的完整序列，分别是I1、I2、B/O和K型（表1）。第一个Z型质粒是在20世纪80年代被描述的，当时pIE545被定义为一个新的不兼容性组IncZ的典型代表（Tsch?pe和Tietze，1983）。pIE545来自1970年代在德国韦尔尼格罗德分离出的Klebsiella pneumoniae（Tsch?pe和Tietze，1983）。不兼容性类型是根据测试两种质粒在同一细菌宿主体内存稳的能力来确定的（Novick，1987）。发现pIE545可以与当时已知的所有不兼容性组的质粒稳定共存，除了IncB/O质粒R16，它与R16之间存在“置换”现象（Tsch?pe和Tietze，1983）。当时由于缺乏序列数据，无法确定这种置换现象在复制子（replicon）身份和Z型质粒与B/O型质粒之间的关系上的具体意义。随后对pIE545产生的conjugative菌毛的形态学和血清学特性的研究将其明确归入I复合体，该复合体的所有成员都能产生短而硬的和长而柔软的菌毛（Bradley，1984）。

20世纪90年代，Pittard及其同事使用“minireplicons”（仅包含野生型拷贝数下稳定复制所需的最小序列的克隆片段）进行实验，得出结论Z型（由pIE545的一个衍生物代表）和B/O型（与参考质粒R16的序列相同）复制子在事实上是不兼容的（Praszkier等人，1991）。因此，Z型质粒与B/O型质粒构成了一个单一的不兼容性组。比较Z型和B/O型复制子的序列后发现，它们在repA复制起始基因上游具有几乎相同的调控元件，这些调控元件是不兼容性表型的主要原因（Praszkier等人，1991）。然而，B/O型和Z型复制子的repA基因编码的RepA蛋白长度不同，分别为343个和290个氨基酸。虽然RepA_B/O与其他I复合体质粒的RepA（统称为RepA_BKI）同源，但RepA_Z与参考质粒IncFII（也称为R100）的RepA1同源，共有250个氨基酸残基（Praszkier等人，1991）。进一步分析pIE545复制子后发现，它是通过涉及I复合体和FII型复制子的重组事件产生的混合体，其中repA_Z上游的调控元件类似于I复合体质粒的调控元件，而repA_Z则类似于FII型质粒的repA1（Praszkier等人，1991）。

< />K. pneumoniae宿主对卡那霉素、新霉素和磺胺类药物的抗性（Tsch?pe和Tietze，1983）。自pIE545被发现以来的几十年里，其他Z型质粒也与多种抗性表型相关，包括临床上非常相关的头孢菌素抗性（Venturini等人，2013；Moran等人，2015；Moran等人，2023；He等人，2019；Stephens等人，2020），但由于复制子分型方案的局限性，它们对全球抗性景观的总体贡献可能被低估了，因为该方案将它们误认为是I复合体的其他成员。2015年有报道称，使用基于PCR的复制子分型方案（针对repA上游的同源区域）将Z型复制子误判为B/O型复制子，因此建议使用针对不同的repA_BKI和repA_Z基因的引物来区分它们（Moran等人，2015）。然而，这一改进尚未纳入PlasmidFinder数据库（Carattoli和Hasman，2020），该数据库仍然仅使用repA上游的原始PCR靶序列来表示B/O型、K型和Z型复制子。随着PlasmidFinder成为全基因组测序时代in silico复制子分型的主要资源（Carattoli和Hasman，2020），在基因组研究中，B/O型、K型和Z型质粒现在常被合并为“B/O/K/Z”类型（Yang等人，2022；Arredondo-Alonso等人，2025；Darphorn等人，2021），这导致了测序数据的信息价值降低。

在这里，我们报告了历史悠久的Z型质粒pIE545的完整序列，并描述了插入其中携带抗生素抗性基因的质粒骨架和TEs。这完善了代表I复合体主要类型的古代质粒序列集，将有助于未来对该重要组的比较研究。

章节片段

培养条件

E. coli JP1290携带pIE545，是从自1990年起保存在悉尼大学Ron Skurray教授收藏中的冻干菌株中复苏的。在37°C下用LB培养基培养过夜并摇动200 rpm后，将菌液划线接种到含有20 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL磺胺甲噁唑的Mueller-Hinton琼脂平板上以筛选pIE545，然后在37°C下培养过夜。选取一个菌落并在LB琼脂上纯化后……

pIE545完整序列的组装和确认

通过使用Sanger测序的PCR产物，将JP1290(pIE545)草图基因组的三个contigs拼接在一起，得到了pIE545的完整序列（图1A）。pIE545的完整序列为109,697 bp。这一结果与之前使用脉冲场凝胶电泳对未处理质粒DNA进行的大小估计相符（Moran和Hall，2019a）。pIE545由一个86.7 kb的骨架组成，在四个位置被TEs打断（图1B）。骨架中的插入片段包含……

在基因组时代识别Z型质粒

由于目前的复制子分型方法难以区分Z型质粒与B/O型和K型质粒，Z型质粒在抗生素抗性基因传播中的作用可能被低估了。然而，多项研究表明Z型质粒明确参与了E. coli的抗性决定因子的携带。多重耐药质粒pO111-CRL₁₁₅及其变体在人类肠出血性E. coli和牛非典型肠致病性E.中被发现。

结论

历史悠久的Z型质粒pIE545的完整序列是现在代表I复合体重型参考质粒的最后一个序列（表1）。这些序列应有助于未来对该组质粒的基因组研究。

CRediT作者贡献声明

Ruth M. Hall：撰写——审阅与编辑、资源收集、方法论、数据分析、概念化。 Robert A. Moran：撰写——审阅与编辑、初稿编写、可视化、验证、方法论、调查、数据分析、数据处理、概念化。