《Reproductive Biology》：Comparative single-cell transcriptomics highlights species-biased developmental trajectories and candidate regulatory modules in primate spermatogenesis
编辑推荐：
理解灵长类睾丸发育对于阐明雄性生育力的进化至关重要。研究人员整合了公开可用的单细胞RNA测序数据集，涵盖从婴儿期到成年期的23个人类和4个猕猴睾丸样本。整合分析鉴定出22种保守的生殖细胞亚型，包括精原干细胞、精母细胞和精子细胞。值得注意的是，一种人类富集的晚期
理解灵长类睾丸发育对于阐明雄性生育力的进化至关重要。研究人员整合了公开可用的单细胞RNA测序数据集，涵盖从婴儿期到成年期的23个人类和4个猕猴睾丸样本。整合分析鉴定出22种保守的生殖细胞亚型，包括精原干细胞、精母细胞和精子细胞。值得注意的是，一种人类富集的晚期精子细胞样转录状态Sperm.C2，富含参与染色质凝集、顶体形成和受精准备的基因，但在本文分析的猕猴数据集中未检测到。比较转录组分析揭示了精原干细胞中与年龄相关的转录动态，反映了人类和猕猴之间物种偏倚的发育策略。此外，预测了CELF4和CTCF等候选调控因子与精原干细胞维持和精子细胞成熟相关。总之，这些发现描绘了控制精子发生的保守和物种偏倚的分子程序，并为理解灵长类生殖细胞发育提供了比较框架。
论文解读：灵长类精子发生的比较单细胞转录组学研究
精子发生是睾丸中高度协调的发育过程，涉及精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）经有丝分裂、减数分裂和精子生成最终形成成熟精子，其精准的时空调控依赖于生殖细胞与支持细胞（如支持细胞、间质细胞和管周肌样细胞）之间的复杂信号网络。这一过程紊乱可导致男性不育，而传统研究多依赖小鼠模型，但小鼠与人类在生殖生物学上存在显著差异。人类与猕猴等非人灵长类在生殖解剖、生理和精子发生进程中更为相似，却也存在发育时相、繁殖策略和精子形态等方面的差异。然而，跨物种比较研究仍十分有限，制约了对灵长类睾丸功能进化及人类生殖疾病分子机制的理解。
为此，研究人员整合了公开可用的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据集，包括23例人类和4例食蟹猴（Macaca fascicularis）睾丸样本，覆盖从婴儿期至成年期的多个出生后发育阶段。经严格质量控制后，保留了72,779个人类细胞和17,715个猕猴细胞，用于全面比较分析。研究结果表明，跨物种整合鉴定出22种保守的生殖细胞亚型，涵盖精原干细胞、精母细胞和精子细胞等。特别地，一种人类富集的晚期精子细胞样转录状态Sperm.C2在猕猴数据集中未被检测到，提示晚期精子发生程序可能存在物种偏倚。比较转录组分析显示，SSCs中的年龄相关转录动态在人类与猕猴间呈现不同策略，且预测了CELF4和CTCF等候选调控因子分别与SSC维持和精子细胞成熟相关。这些发现为理解灵长类精子发生的保守性与物种特异性提供了比较框架，并为人类生育力及年龄相关睾丸功能衰退研究提供了新假设。该论文发表于《Reproductive Biology》。
在技术方法上，研究人员利用来自Gene Expression Omnibus（GEO）和ArrayExpress的公共scRNA-seq数据，其中人类样本源自Sohni等（2019）、Zhao等（2020）和Guo等（2018）的研究，猕猴样本源自Lau等（2020）。他们使用Seurat v4.1.0进行标准化、主成分分析及Harmony批次整合，并通过图聚类识别细胞亚群；采用BioMart将猕猴基因映射至人类直系同源基因，保留12,647个共享基因进行跨物种比较；运用Monocle3构建拟时序轨迹；使用pySCENIC推断转录因子调控子活性，并以AUCell进行跨物种比较；差异表达与富集分析使用Wilcoxon秩和检验和clusterProfiler等工具。
研究结果部分按原文小标题总结如下：
3.1 人类和猕猴睾丸出生后发育的单细胞转录组图谱。通过整合23例人类和4例猕猴睾丸scRNA-seq数据，联合UMAP聚类揭示了22个保守生殖细胞亚型，包括未分化精原干细胞（SSC.C1、SSC.C2）、分化精原细胞（SPG.C1）、减数分裂精母细胞、圆形精子细胞（RS.C1–3）、延长精子细胞（ES.C1–2）及晚期精子细胞样状态（Sperm.C1–30）。标记基因热图验证了细胞身份，并发现人类富集的Sperm.C2在猕猴中缺失。
3.2 晚期精子细胞成熟的跨物种差异突出物种偏倚的转录程序。相关性分析显示聚类主要按发育阶段而非物种划分，表明阶段特异转录程序高度保守。Sperm.C2与Sperm.C3的差异表达分析显示，Sperm.C2富集参与染色质凝缩（TNP2）、脂质转运（FABP3）、轴丝组装（ODF1）及顶体相关结构（CDRT4、SLFNL1）的基因，GO富集到精子细胞发育、顶体组装、纤毛运动和线粒体呼吸等过程，GSEA则富集到细胞识别和精卵相互作用通路，提示Sperm.C2可能代表一种人类特异性的晚期精子细胞成熟状态。
3.3 精原细胞发育早期出现物种特异性调控模块。通过拟时序基因模块分析，人类鉴定出15个动态模块，猕猴有14个，Jaccard相似性显示跨物种重叠有限。共享模块基因富集Wnt信号、轴突发生和细胞连接等保守过程；人类特异性模块基因与转录调控和细胞连接组织相关，猕猴特异性模块基因则富集缺氧反应、碳水化合物代谢和膜结构相关功能，说明早期生殖细胞发育已出现物种偏倚的调控网络。
3.4 物种偏倚的转录程序在SSC中建立并持续至早期精原细胞发育。差异表达分析显示，人类精原细胞中上调基因包括SKP1、UBE2E3和PAIP2等，与泛素介导的蛋白质稳态和翻译起始控制有关；猕猴富集基因如APOE、ATP6V0C和BSCL2则涉及脂质转运、自噬和囊泡酸化。共有930个人类上调和425个人类下调基因在SSC.C1、SSC.C2和SPG.C1中一致差异表达，表明该分歧稳定持续。基于这些基因的机器学习分类器能以高AUC区分物种。
3.5 衰老诱导SSC和SPG的探索性物种偏倚转录变化。比较青少年与成年的SSC和SPG转录组，人类成年SSC上调CRISP2、FGFR3等与翻译调控和有丝分裂相关基因，青少年则富集IGFBP7、APOE等氧化还原和线粒体功能基因；猕猴成年SSC上调CST3、SPARCL1和APOE，体现促炎或脂质加工特征，而青少年富含基因组完整性相关基因。跨物种重叠极少，表明衰老反应高度物种和细胞类型特异。
3.6 人类SSC和SPG的转录调控景观揭示CELF4为候选因子。通过SCENIC调控子分析，CELF4调控子活性在人类SSC.C1中显著富集，并随分化进程逐渐降低，且在猕猴中呈现保守模式，提示CELF4可能与早期精原干细胞维持相关。
3.7 年龄相关转录调控突出CTCF相关活性与SSC成熟。人类中CTCF、KDM5A、SP1和NR2C2调控子活性随年龄增加，CTCF在成年SSC.C1中显著高于儿童和青少年；但猕猴中成年CTCF活性反而低于青少年，表明该年龄相关方向存在物种差异。
在讨论部分，研究人员总结了关键发现：精原干细胞阶段即出现转录分歧，人类更侧重转录/翻译调控，猕猴更偏向代谢、缺氧反应和细胞骨架动态；Sperm.C2提示人类可能具有特化的晚期精子成熟程序，但仍需验证；CELF4和CTCF相关调控子分别与干细胞维持和年龄相关成熟关联。研究还存在局限性，包括基于公共数据的推断缺乏实验验证、发育阶段匹配近似、猕猴样本量少以及富集分析仅提供功能注释等。
结论部分翻译如下：总之，这项对人类和猕猴睾丸的跨物种单细胞转录组研究提供了关于灵长类精子发生进化与发育差异的关键见解。研究强调转录分歧在SSC阶段即已建立，提示人类和猕猴在生殖细胞调控中采用不同的分子策略。人类富集的晚期精子细胞样转录状态Sperm.C2的鉴定提示了晚期精子发生的潜在物种偏倚特征，但需要进一步验证。此外，CELF4和CTCF相关调控子被分别与精原细胞身份和年龄依赖性生殖细胞成熟相关联。这些发现提供了一个比较分子框架，增进了对灵长类生殖生物学的理解，并为研究人类不孕症和年龄相关生殖衰退提供了假设。
