飞蝗蛋白水解物的表征及其对吡虫啉诱导细胞毒性的细胞保护作用

《Scientific African》：Characterization of Locusta migratoria protein hydrolysates and their cytoprotective effects against imidacloprid-induced cytotoxicity

　　

摘要：近年来，全球对可持续蛋白质来源日益增长的需求已将注意力转向食用昆虫蛋白，如飞蝗（Locusta migratoria），其富含具有潜在健康益处的生物活性肽。然而，蝗虫蛋白水解物（LPHs）对农药残留的保护作用，尤其是对仍在农业中广泛应用的吡虫啉（IMI）的保护作用，仍未得到充分探索。本研究旨在分离和表征飞蝗蛋白，通过胃蛋白酶水解制备水解物，并评估其在HepG2细胞系中对IMI毒性的抗氧化能力和细胞保护作用。研究人员分离蝗虫蛋白，用胃蛋白酶（0.5-2小时）水解，并通过FTIR、SDS-PAGE和LC-MS/MS进行表征。使用DPPH和ABTS测定法在体外评估自由基清除能力。通过MTT测定法在HepG2细胞中暴露于IMI 48小时来评估细胞保护作用。分离的蝗虫蛋白含有48.10 mg/g疏水性氨基酸和24.82 mg/g亲水性氨基酸。胃蛋白酶水解的进程使水解度（DH）在2小时时从33.72%增加至62.11%。纳米LC-MS/MS分析鉴定出36种蛋白质，对其进行计算机模拟分析以预测这些蛋白质可能释放的抗氧化肽基序，这些肽可能适用于后续研究中的合成。DPPH清除活性在2小时时从35.37%增加至74.45%，而ABTS活性在0.5小时时达到峰值38.74%。LPH（0.5小时）的IC??为426 μg/mL，并在31.25-125 μg/mL浓度下将IMI细胞毒性降低约50%。IMI与LPH联合处理增加了Caspase-3表达，在250 μg/mL时达到未处理对照的6.105倍。LPH（0.5小时）对IMI毒性表现出细胞保护作用，可建议作为减轻农药毒性的天然细胞保护剂。建议进一步开展体内研究以在生物模型中验证这些发现。

**论文解读：飞蝗蛋白水解物的表征及其对吡虫啉诱导细胞毒性的细胞保护作用**

**1. 研究背景与问题**

全球人口增长预计到2050年将达到86亿，对可持续蛋白质来源的需求日益迫切。食用昆虫蛋白因其高蛋白含量（占干重40–75%）和较低的环境足迹，被认为是传统蛋白质的可持续替代品。飞蝗（*Locusta migratoria*）作为欧盟认可的新型食品，其蛋白含量约为干重的50–62%，且富含具有抗氧化、抗癌、抗高血压等活性的生物活性肽（BAPs）。然而，昆虫蛋白的利用仍面临消费者接受度、致敏性以及加工技术优化等挑战。已有研究多聚焦于飞蝗蛋白水解物的通用抗氧化活性（DPPH、ABTS）和技术功能特性，但尚未探索其对特定毒理学挑战——尤其是农药残留——的细胞保护潜力。吡虫啉（IMI）是一种广泛应用的烟碱类杀虫剂，通过作用于烟碱型乙酰胆碱受体而发挥毒性。近期研究表明，IMI可在人肝HepG2细胞中诱导细胞毒性和氧化应激，在24小时暴露下，10 μg/mL浓度即可降低细胞活力，其肝毒性机制涉及活性氧（ROS）生成、脂质过氧化和线粒体功能障碍。因此，寻找能够减轻农药细胞损伤的天然细胞保护剂具有重要的公共卫生意义。本研究旨在填补飞蝗蛋白水解物（LPHs）对IMI诱导细胞毒性保护作用的研究空白，探索其作为功能性食品或膳食补充剂的潜在应用。

**2. 研究目的与主要技术方法**

该研究由埃及扎加齐格大学的研究人员（Heba Nasr、Mohamed Hendawi、Didair Ragheb、Ali Osman）完成，发表于《Scientific African》。研究从泰国Unique公司（JR Unique Foods Ltd.）获得飞蝗冻干粉，采用碱溶酸沉法提取蛋白，用胃蛋白酶在37°C、pH 2.0条件下水解（酶底比0.5% w/w，时间0.5–2小时）。使用的主要关键技术方法包括：傅里叶变换红外光谱（FTIR）监测蛋白二级结构变化；SDS-PAGE分析分子量分布；纳升液相色谱-串联质谱（Nano-LC-MS/MS）鉴定蛋白组成；DPPH和ABTS法评估自由基清除能力；MTT法测定细胞活力与细胞毒性；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测Caspase-3 mRNA表达；计算机模拟筛选使用BIOPEP-UWM数据库和PeptideRanker工具预测抗氧化肽。此外，氨基酸组成使用SYKAM高效氨基酸分析仪测定。

**3. 主要研究结果**

**蛋白与水解物表征**：飞蝗分离蛋白（LPI）中必需氨基酸中赖氨酸（9.59 mg/g）、组氨酸（9.32 mg/g）和苯丙氨酸（8.84 mg/g）含量丰富，色氨酸未检出。按化学性质分组，疏水性氨基酸（48.10 mg/g）约为亲水性氨基酸（24.82 mg/g）的两倍。胃蛋白酶水解过程中，水解度（DH）在前0.5小时迅速达到33.72%，2小时时升至62.11%。FTIR光谱显示水解物中酰胺I带和酰胺II带强度降低，酰胺III区域出现波动，表明α-螺旋和β-折叠结构被破坏。SDS-PAGE显示天然蛋白有5条主要条带（10–250 kDa），水解后高分子量条带强度降低，出现新的低分子量条带。

**LC-MS/MS蛋白鉴定**：对0.5小时水解物的SDS-PAGE目标条带进行纳升LC-MS/MS分析，鉴定出36种蛋白（置信度≥95%），共3878个肽段。蛋白长度从58到3380个氨基酸不等，预测抗氧化肽数量从6到116个不等。最长蛋白（3380个氨基酸）预测产生116个肽。使用PeptideRanker评分，排名靠前的预测抗氧化肽包括PWW（0.9968）、FC（0.9960）、FGF（0.9966）和CW（0.9958），这些短肽富含芳香族和疏水性残基。

**体外抗氧化活性**：DPPH清除活性从天然蛋白的35.37%显著增加至水解物的71.92%（0.5小时）至74.46%（2小时）。ABTS清除活性在0.5小时达到峰值38.74%，随后随水解时间延长而下降至2小时的30.42%。Pearson相关分析显示，DH与DPPH活性呈强正相关（r=0.926），而与ABTS活性呈负相关（r=-0.252）。因此选择0.5小时水解物用于后续细胞保护实验，因其在两种测定间达到最佳平衡。

**细胞毒性与细胞保护作用**：MTT测定显示，LPH（0.5小时）对HepG2细胞的IC??为426 ± 9.21 μg/mL，高于LPI（609 ± 3.19 μg/mL）而低于IMI（353 ± 4.55 μg/mL）。在细胞保护实验中，以IMI的IC??（353 μg/mL）与不同浓度LPI（Mix A）或LPH（Mix B）联合处理48小时。在31.25–125 μg/mL浓度范围内，两种混合物均表现出保护作用，其中31.25 μg/mL时约达50%保护率。Mix B的保护效果始终优于Mix A，尤其在62.5 μg/mL（48.40% vs 44.46%）和125 μg/mL（26.95% vs 3.43%）时。但浓度≥250 μg/mL时，两种混合物均表现出毒性效应。形态学观察支持上述结果，Mix B处理的细胞在相当浓度下展现出更好的细胞完整性和更少的形态损伤。

**Caspase-3基因表达**：与IMI单独处理相比，LPI和LPH联合处理均浓度依赖性地增加Caspase-3 mRNA表达。LPI联合组在62.5、125和250 μg/mL时分别上调3.23、4.35和5.66倍；LPH联合组相应为2.73、5.03和6.11倍。Caspase-3表达的上升反映了细胞对治疗诱导应激的凋亡反应增强。

**4. 讨论与结论**

讨论部分指出，LPI的氨基酸组成凸显其营养价值，疏水性氨基酸占优可能增强其功能和抗氧化特性，但色氨酸缺失需通过膳食补充改善。胃蛋白酶水解效率高，快速水解后平台期可能归因于底物耗尽或肽抑制。FTIR和SDS-PAGE证实了酶解引起的结构改变，暴露了氨基酸残基和反应性肽键，从而释放生物活性肽，这与观察到的抗氧化活性增强相关。计算机模拟预测的抗氧化肽（如PWW、FGF等）虽具有高评分，但研究者强调这些仅为计算预测，并非实验测量值，需通过肽的分离合成及独立活性测定进行验证。水解物比天然蛋白表现出更强的细胞保护作用，可能归因于更小肽段具有更高的细胞通透性。Caspase-3表达的增加可能反映凋亡通路的激活，但两种蛋白制剂在高浓度下反而显示毒性，提示其生物效应具有浓度依赖性。研究局限性包括仅使用单一细胞系（HepG2）、仅用胃蛋白酶水解、缺乏体内验证以及未纯化单一生物活性肽。

结论表明，飞蝗蛋白水解物在体外具有显著的抗氧化和细胞保护潜力，这归因于水解过程中产生的生物活性肽。0.5小时水解物在31.25–125 μg/mL浓度下对IMI细胞毒性提供约50%保护，IC??为426 μg/mL。未来需要在体内模型中验证这些发现，评估胃肠道稳定性和生物利用度，并进行全面的安全性评价，同时采用多酶模拟消化探究肽谱，纯化并鉴定特定肽以建立构效关系，从而为LPHs作为天然细胞保护剂的商业应用奠定基础。