基于重力的微流控平台，用于从复杂的虾类肝胰腺中高效分离Enterocytozoon hepatopenaei的DNA（通过磁固相萃取法实现）

《Talanta》：Gravity-driven millifluidic platform for magnetic solid-phase extraction of Enterocytozoon hepatopenaei DNA from complex shrimp hepatopancreas

　　

摘要

在水产养殖中，有效检测Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）目前受到缺乏可在现场使用的提取方法的阻碍，这些方法能够处理复杂且含有大量抑制剂的肝胰腺组织。本研究提出了一种基于重力的微流控平台，利用优化的、与表面活性剂兼容的磁固相提取（MSPE）化学方法快速提取EHP基因组DNA。该平台使用5% PEG 8000和2.0 M NaCl，能够从富含抑制剂的甲壳类动物裂解液中选择性捕获DNA。这种3D打印设备采用倾斜摇动板产生被动重力驱动的流动，维持磁珠悬浮液的均匀性，并在无需外部泵的情况下提高固相捕获效率。该集成平台的DNA产量为2804.33 ± 15.31 ng/μL，比手动磁珠提取方法提高了5.9倍。针对EHP SSU rRNA基因开发了TaqMan定量PCR（qPCR）验证方法。通过使用范围从10¹到10⁷倍质粒拷贝的标准曲线（Ct = ?3.611 log₁₀ [copy] + 42.309，R² = 0.998，扩增效率89.2%），芯片上的MSPE方法实现了1个孢子的检测限（LOD）（100%的检测率，n = 21），而商业CTAB基DNA提取试剂盒即使在10个孢子的情况下也未能达到验证的LOD（85.7%，18/21）。为了进行现场评估，还使用了针对SWP基因的嵌套PCR。在两个队列（N = 40）中的初步研究表明，能够一致地检测到确认的EHP阳性案例；然而，由于样本量较小，无法确定诊断的准确性。该平台的总处理时间不到30分钟，提供了一个高效的提取模块。未来的工作将把该设备与等温扩增技术（例如LAMP或RPA）结合，以实现资源有限的水产养殖中的样本到结果系统。

引言

全球虾类水产养殖业的可持续性正日益受到新兴传染病的威胁，其中Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）是一个关键问题。这种专性细胞内微孢子虫攻击对虾的肝胰腺，尤其是Penaeus vannamei，导致慢性肝胰腺微孢子虫病。由此导致的生长受阻和收获量变化造成了全球范围内的严重经济损失[1]，[2]。因此，实施严格的生物安全框架在感染早期阶段快速准确地检测EHP至关重要[3]，[4]。

虽然传统的诊断方法如湿装显微镜和组织病理学可以提供孢子存在和相关组织病变的形态学验证，但它们在灵敏度和通量方面存在固有的局限性[5]，[6]。尽管原位杂交（ISH）提高了特异性，但这些基于显微镜的技术劳动强度大且需要专门的基础设施，不适合高通量筛选[7]，[8]。因此，包括PCR和qPCR在内的核酸扩增测试（NAATs），针对保守位点如SSU rRNA，由于其优异的检测限（LOD）已成为分析的金标准[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]。然而，这些分子检测的分析可靠性严格取决于上游样本制备的质量。虾的肝胰腺是一个复杂的基质，包含几丁质衍生物、酸性多糖、脂质和多酚，这些成分会不可逆地破坏PCR中的酶活性[16]。另一个挑战来自微孢子虫的生物学特性：EHP孢子具有厚实的、富含几丁质的壁，对温和的化学裂解具有抵抗力。因此，任何成功的提取流程都必须（i）有效破坏孢子以释放基因组DNA，以及（ii）去除共提取的抑制剂，以获得适合扩增的模板[17]。

历史上，溴化鲸蜡三甲基铵（CTAB）提取方法一直是处理植物和微孢子虫样本的基准方法。作为一种阳离子表面活性剂，CTAB在高盐条件下有助于选择性沉淀酸性多糖和破坏膜[18]，[19]，[20]，[21]，[22]。当与有机提取（如酚/氯仿或氯仿/异戊醇）和机械破坏（例如珠磨）结合使用时，CTAB流程能有效裂解壁厚的孢子，并去除虾组织中常见的脂质和蛋白质[23]，[24]，[25]，[26]。然而，传统的CTAB流程操作繁琐：它需要大量的溶剂，具有危险性，耗时较长，并且依赖于高速离心，这些特点使其主要局限于中央实验室，无法用于现场应用[27]，[28]，[29]，[30]。

为了满足现场诊断的需求，利用顺磁颗粒的固相提取（SPE）作为一种稳健的替代方法应运而生。磁珠（MBs）提供了高表面积与体积比，有利于核酸结合，并消除了对离心机的需求，简化了工作流程，使其适合自动化[31]，[32]，[33]，[34]，[35]。特别是二氧化硅涂层的磁珠，具有较高的DNA结合能力，非常适合板式处理[36]。重要的是，将基于磁珠的SPE（MSPE）与微流控或微流控架构结合，代表了向真正的即时检测（POC）测试迈出的重要一步[37]。微流控平台提供了独特的分析优势，包括精确的流体操控、减少试剂消耗、快速的反应动力学以及在封闭系统内控制生物危害[38]。最近的文献表明，在微流控通道中加入磁驱动方式可以提高混合效率，并促进珠结合的分析物通过不同的洗涤和洗脱区的主动传输，与静态台式协议相比显著简化了样本到结果的时间线[39]，[40]。尽管取得了这些进展，但将稳健但粘稠且化学性质强烈的CTAB裂解方法适应于微流控平台进行EHP孢子分析仍然是一个尚未充分探索的分析挑战。

在这项研究中，开发了一种用于快速提取基因组DNA的微流控平台，以实现EHP的敏感检测。本工作的具体目标是：（1）建立并优化一个无需离心的CTAB–MSPE裂解系统，以从复杂的虾基质中高效提取EHP基因组DNA；（2）将该优化的化学方法转移到微流控设备上，验证其用于简化EHP检测的性能。为此，研究了MSPE条件，特别是结合缓冲液（盐和PEG浓度）和洗脱缓冲液。将分析性能与传统的CTAB–酚/氯仿和柱基方法进行了比较。最后，通过使用提取的DNA进行下游嵌套PCR检测和TaqMan定量PCR对实际样本进行了验证。

章节摘录

材料与试剂

白腿虾（Penaeus vannamei）样本从中国重庆的本地市场购买。EHP样本由Xunjian Life Sciences Co., Ltd.（中国重庆）提供。

二氧化硅涂层的羧基磁珠（约1 μm）从Duyou Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）购买。CTAB裂解缓冲液和CTAB试剂盒从Yuanye Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）购买。NA-Red 2000×从Beyotime Co., Ltd.（中国上海）购买。聚乙烯

CTAB-磁珠SPE参数和缓冲液化学的优化

直接将磁固相提取应用于富含CTAB的裂解液中存在明显挑战，主要是由于表面活性剂的携带和甲壳类组织基质的高粘度，这些基质富含多糖和脂质[41]，[42]，[43]。为了克服这些困难，我们系统地优化了提取过程的物理和化学参数，以最大化DNA回收率，同时确保下游应用的高纯度。

初步实验确立了

结论

本研究成功开发了一种基于重力的微流控平台，用于从复杂的甲壳类动物组织基质中快速提取EHP基因组DNA。优化的CTAB-MSPE化学方法使用5% PEG8000和2.0 M NaCl，有助于选择性捕获基因组DNA。将这种化学方法转移到3D打印的微流控设备上，消除了对外部注射泵的需求，而是依靠被动倾斜振荡器来驱动流体运动。从分析角度来看，芯片上的

CRediT作者贡献声明

Yirong Chen：撰写——原始草稿，可视化，验证，方法学，数据管理。Xianlong Shi：撰写——原始草稿，方法学，数据管理，概念化。Yingshuai Liu：资源，项目管理。Xiaoqing Chen：数据管理。Ke Ning：可视化，方法学，正式分析。Quan Sun：资源，方法学，数据管理。Ling Yu：撰写——审查与编辑，项目管理，资金获取，概念化。Guoqing Pan：撰写——审查与

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数据可用性

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在准备这项工作时，作者使用了KIMI（Instant）进行语言润色。输入提示包括：“请校对以下文本，消除语法错误和拼写错误”。作者对提交的手稿最终内容负全责。

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致谢

这项工作得到了资源昆虫国家重点实验室和西南大学（开放研究基金SKLSGB— ORP202205）的财政支持。

Xianlong Shi|Yirong Chen|Quan Sun|Ke Ning|Xiaoqing Chen|Yingshuai Liu|Guoqing Pan|Ling Yu

中国西南大学材料与能源学院清洁能源与先进材料研究所，发光分析与分子传感国家重点实验室，重庆400715