对照参考的细菌生物发光揭示了良性与恶性乳腺疾病中的双轴唾液反应表型

《Talanta》：Control-referenced bacterial bioluminescence reveals a two-axis salivary response phenotype in benign and malignant breast disease

　　

摘要
唾液是一种复杂的异质性生物流体，其基质效应会显著影响生物传感器的性能。在此，我们展示以对照为参考的细菌 NAD(P)H:FMN 氧化还原酶 - 荧光素酶动力学提供了这些基质效应的紧凑功能读出，并揭示了乳腺疾病中结构化的唾液反应表型。我们分析了 200 份临床注释的唾液样本，代表健康对照、良性乳腺疾病、早期乳腺癌和晚期乳腺癌。从配对样本 - 对照曲线中提取了三个描述符：残留发光强度 (LI%)、拟合面积比 (??) 和动力学位移 (??)。面积和动力学描述符形成了结构上关联的 ??–?? 坐标，而 LI% 代表了一种 largely 独立的振幅响应。主成分分析 (PCA) 提供了解释性坐标表示，其中 PC1 主要总结 ??–?? 变异，PC2 主要由 LI% 主导。这种载荷几何结构对非线性年龄调整和重复等量组子采样是稳定的。健康、良性和恶性组占据重叠但方向偏移的反应空间区域，其中良性乳腺疾病显示出相对于健康对照的最大位移，主要沿振幅相关坐标。这些发现支持细菌生物发光曲线分析作为一种探究唾液基质生物学功能方法，并表明曲线衍生的描述符保留了仅终点发光无法提供的信息。

引言
唾液已成为一种有前景的生物流体，用于无创生物分析，因为它易于获取，可重复采集，并能反映局部和全身生理状况 [1], [2], [3], [4], [5], [6]。它含有广泛的蛋白质、代谢物、电解质、核酸、细胞外囊泡和微生物成分。然而，唾液并非简单的惰性载体流体，而是一种化学异质性基质。其成分，包括粘度、离子强度、蛋白质含量和氧化还原活性分子，可以显著调节基于酶的生物传感器的输出 [7], [8], [9]。对于此类系统，基质效应不仅仅是分析上的烦恼：它们还可能提供唾液生化状态的功能读出。对关注基质的检测设计的广泛分析需求并非唾液独有；最近在另一种复杂生物流体牛乳中的直接分子检测同样需要在化学异质性样本环境中运行检测 [10]。

乳腺癌仍然是主要的全球健康问题，在既有影像学和组织诊断的同时，寻找微创辅助性生物流体方法的研究仍在继续 [11]。既往乳腺疾病的唾液研究主要采用代谢组学、蛋白质组学、转录组学和亲和力传感器方法 [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]。多元分析进一步显示，唾液中的疾病关联信息可能分布在与相互作用的生化特征中，而非集中在单一分析物中 [20]。尽管这些研究很有价值，但它们通常是在经典生物标志物发现范式内构建的。一种互补的生物传感器视角是询问唾液是否在酶偶联光学系统中产生可重复的功能反应表型。在此选择唾液并非假设其内在优于血清，而是因为它代表了一种独特的分析基质，将腺体分泌与口腔、粘膜和微生物贡献整合在一起，同时仍适合重复无创采样。这些特性使其与依赖酶反应物理化学环境的基质响应检测特别相关。最近的证据还表明，唾液不仅仅是乳腺疾病中血清的稀释替代物。在一项针对乳腺癌、良性乳腺疾病和健康女性对照的血清和唾液的参与者内 ATR-FTIR 比较中，这两种流体显示出涉及脂质、蛋白质、核酸和糖原的 distinct 生化指纹。2930 cm?1 处的脂质相关唾液条带在三组临床组间存在差异，而相应的血清特征未能区分乳腺癌与良性乳腺疾病 [21]。这些发现支持将唾液作为独特的疾病响应基质，并强调需要结合其生物流体特异性成分来解释生物传感器输出。

生物发光酶系统非常适合这一目的，因为它们的光输出直接报告偶联的生化转化。细菌荧光素酶在与 NAD(P)H:FMN 氧化还原酶偶联时，通过一系列反应产生光，该反应序列依赖于还原型黄素供应、氧气可用性、酶偶联效率和局部物理化学环境 [22], [23]。产生的光输出对氧化还原活性化合物、粘度、底物可用性和抑制性相互作用敏感 [24], [25], [26]。我们并不假设这种氧化还原酶 - 荧光素酶对在普遍上优于荧光或替代的生物发光系统（未进行实验比较）。相反，它对于当前问题是分析上有用的，因为基质依赖性扰动可以改变偶联的氧化还原依赖性发光反应的 magnitude 和 time course。细菌生物发光检测已用于生态、毒理学和生物医学分析 [27], [28]，包括最近的适用于唾液的检测用于监测人类生理状态 [29], [30], [31]。从这个角度看，唾液可以被视为偶联氧化还原酶 - 荧光素酶反应的复杂内源性修饰剂。

在本研究中，我们分析了 200 名参与者的非刺激唾液获得的以对照为参考的生物发光曲线，包括健康对照、良性乳腺疾病、早期乳腺癌和晚期乳腺癌。选择了三个描述符以提供测量的上升响应互补方面的紧凑表示：残留发光强度 (LI%) 作为直接以对照为参考的振幅描述符，拟合面积比 (??) 作为拟合光输出轨迹的集成测量，以及动力学位移 (??) 作为拟合时间尺度上的样本 - 对照差异。未使用峰值时间、衰变常数或拐点等替代量，因为分析的曲线部分由单调指数饱和模型表示，该模型不包含衰变阶段、有限峰值或拐点。因此，这些描述符旨在作为紧凑的分析坐标集，而不是三个独立的候选生物标志物。

我们询问这些配对样本 - 对照描述符是否表现出可重复的联合组织，相应的坐标几何结构在年龄模型指定、治疗调整、异常值处理和不等组大小下是否稳定，以及健康、良性和恶性乳腺疾病组如何占据这一反应空间。PCA 用作三个描述符反应的解释性坐标变换，而不是作为内在低维度的证明。负面结果将包括弱或不稳定的描述符关系、敏感性分析下 materially different 的载荷几何结构，或缺乏可重复的组位移。这种框架将分析问题与随后在数据中观察到的特定结构分开。

章节片段

研究设计与队列
这是一项回顾性单中心分析唾液生物发光测量。队列包含 200 名排除一条无标签记录后具有有效临床标签的参与者。本分析使用的生物组包括健康对照 (n = 25)、良性乳腺疾病 (n = 26)、早期乳腺癌对应分期 0–II (n = 83) 和晚期乳腺癌对应分期 III–IV (n = 66)。因此非恶性组由 51 名参与者组成。

原始描述符提示健康与良性非恶性唾液不等价
四个生物组在年龄分布和以对照为参考的生物发光描述符模式上存在差异（表 1）。健康对照的中位 LI% 低于良性组（48.53 对 78.87），而 ?? 在健康对照中倾向于高于癌症组。动力学位移 ?? 在中位健康和良性样本中为负值，但在早期和晚期癌症组中接近零或为正值。这些描述性差异表明良性乳腺疾病...

讨论
本研究表明以对照为参考的细菌生物发光动力学提供了紧凑的唾液基质效应功能读出。而非仅依赖终点发光强度，拟合反应轨迹的分析产生了解释性反应空间组织，包括一个振幅主导坐标和一个积分 - 动力学坐标。PCA 在此主要用作三个预设描述符的坐标变换。仅有三个输入，且...

结论
以对照为参考的细菌生物发光曲线提供了结构化的唾液基质效应功能读出。三描述符反应可由两个可解释坐标表示：一个振幅主导的 LI% 分量和一个积分 - 动力学 ??–?? 分量。这些坐标的方向在非线性年龄调整、异常值敏感性分析和重复等量组子采样下保持稳定。
健康对照、良性乳腺疾病和乳腺癌组

CRediT 作者贡献声明
波琳娜·A·马尔季丘克：写作 – 回顾与编辑，可视化，调查，形式分析。加丽娜·V·朱科娃：写作 – 回顾与编辑，方法论，数据管理，概念化。柳德米拉·V·别尔斯卡亚：写作 – 回顾与编辑，方法论，调查，数据管理，概念化。叶莲娜·A·萨尔夫：写作 – 回顾与编辑，方法论，数据管理。安德烈·N·舒瓦耶夫：写作 – 原稿，可视化，验证，监督，方法论，形式分析，

伦理声明
本研究符合《赫尔辛基宣言》原则。关于肿瘤疾病患者唾液生化特征调查的方案于 2024 年 3 月 20 日经鄂木斯克国立师范大学伦理委员会批准（方案号 No. 46-04/2）。批准的临床研究框架随后得到扩展，以扩大在患者队列中评估的唾液代谢物和功能性生化读出范围。书面

资助
本研究由俄罗斯联邦科学与高等教育部国家任务资助（项目号 FWES-2024-0018）。资助方在研究设计、数据收集、分析、解释、手稿准备或提交文章的决定中未发挥任何作用。

利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：瓦莲京娜·克拉塔休克报告获得了俄罗斯联邦科学与高等教育部国家任务的财务支持。如果有其他作者，他们声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能被认为会影响本文报告的工作。

波琳娜·A·马尔季丘克 | 加丽娜·V·朱科娃 | 柳德米拉·V·别尔斯卡亚 | 叶莲娜·A·萨尔夫 | 安德烈·N·舒瓦耶夫 | 瓦莲京娜·A·克拉塔休克
西伯利亚联邦大学基础生物学与生物技术研究所，79 Svobodny Prospect, Krasnoyarsk, 660041, 俄罗斯