《Talanta》：A Four-Way Calibration Strategy Based on Photo-Reaction Time-Dependent Excitation–Emission Fluorescence Matrices. Simultaneous Analysis of Four Quinolones in Complex Samples with Highly Overlapped Signals.
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摘要旨在定量组织样品中的四种兽用喹诺酮类，开发了一种获取三阶数据以构建四阶校准策略的新方法。该方法基于记录作为喹诺酮光反应时间函数的激发 - 发射荧光矩阵。采用简单的自制光反应器来引发光降解过程，引入额外的模式以提高选择性。使用快速扫描光谱荧光计在总反应时间 10 分钟内按固
摘要
旨在定量组织样品中的四种兽用喹诺酮类，开发了一种获取三阶数据以构建四阶校准策略的新方法。该方法基于记录作为喹诺酮光反应时间函数的激发 - 发射荧光矩阵。采用简单的自制光反应器来引发光降解过程，引入额外的模式以提高选择性。使用快速扫描光谱荧光计在总反应时间 10 分钟内按固定间隔收集激发 - 发射矩阵。为了克服复杂基质中严重的频谱重叠和存在未校准干扰物的问题，选择展开偏最小二乘法结合残差三线性化 (U-PLS/RTL) 作为分析所得数据的模型。为了避免散射信号，在化学计量分析期间限制了光谱数据范围。通过该方法，在组织样品中所有目标分析物的回收率值均达到 83 % 至 126 % 之间，符合既定指南。检测限和定量限分别为 4 至 15 μg kg-1 和 12 至 50 μg kg-1。此外，预测相对误差 (REP) 低于 9 %。最终，所提出的方法除了代表生成高阶数据的另一种方式外，还通过简化的提取和净化方案、缩短的分析时间以及使用中等复杂度的仪器，促进了复杂样品中喹诺酮类的测定。
引言
近年来，产食品动物中抗生素的使用量显著增长，主要是全球对动物源性食品需求不断增加的结果。在养鸡业中，抗生素被广泛使用，不仅用于疾病预防和治疗，还用作生长促进剂以提高饲料效率和整体生产率 [1]。使用不当可能导致可食用禽肉组织中存在抗生素残留 [2]，[3]。通过饮食摄入，这些残留对人类健康构成潜在风险，主要是由于抗菌耐药性的发展 [4]，[5]，[6]，[7]，[8]。广泛用于此目的的一类抗生素是喹诺酮类 (Qs)，一组合成抗生素，对多种致病菌表现出广谱活性 [9]。由于其在临床上的重要性，世界卫生组织将此类抗菌剂归类为关键重要，赋予其最高保护优先级，以确保其在治疗人类严重细菌感染时继续有效 [10]。尽管它们对人类健康至关重要，但喹诺酮类药物也在兽医学中广泛使用，特别是在产食品动物中，家禽生产是这些药物应用的主要部门之一 [11]。
科学文献中报道了多种 Qs 定量分析方法；其中，分析分离技术是最广泛使用的 [12]，[13]，[14]。与质谱联用的色谱方法确保高灵敏度，但需要昂贵且耗时的样品制备来处理复杂食品基质。此外，高昂的仪器成本和需要训练有素的人员阻碍了它们的常规应用，与更简单和更易获得的分析替代方案相比，这些是主要缺点 [15]，[16]，[17]。虽然光谱方法提供绿色、低成本优势，并使用简单仪器且不需要高度训练的人员，但它们通常表现出有限的选择性。因此，它们应用于喹诺酮类分析仅限于单一分析物测定或定制化学试剂和严格的实验条件 [18]。为了同时测定多种 Qs 或在复杂基质中定量，已开发了采用光谱信号获取多维数据，并结合化学计量工具的方法 [19]，[20]，[21]，[22]。
喹诺酮类可表现出具有不同量子产率的天然荧光；然而，它们的激发和发射光谱通常位于同一狭窄波长范围内，导致高度的频谱重叠，从而阻碍直接发光定量。事实上，当来自不同化合物之间的重叠产生内在非选择性信号时，无论是分析物之间还是分析物与基质干扰物之间，单变量校准都不适用 [23]。在这种情况下，化学计量学作为一种有价值的补充工具出现，其中多变量校准模型允许克服频谱重叠，而不考虑数据阶数。然而，当干扰来自校准步骤中未包含的复杂样品基质时，必须利用二阶优势，这是高阶数据的一种内在属性。为此，本工作提出了一种化学计量辅助的光谱 - 光动力学方法学，通过使用多路模型最小化样品前处理。在这方面，这些模型提供了有效的数学替代方案以恢复分析选择性，从而利用二阶优势避免或减少繁琐的实验操作，即使在存在未校准和意外化合物的情况下也能实现分析物定量 [24]。
向数据引入额外模式可增加灵敏度和选择性，因为每个新的仪器模式都对系统整体选择性做出积极贡献，而冗余数据点的测量减轻了噪声对信号的相对影响。因此，三阶数据和四阶校准通过引入更多分析信息提高了模型预测性能 [23]，[25]。此外，这些高阶数据的主要优势是它们处理高信号共线性问题的能力，这是较低的二阶数据和三阶校准无法克服的局限性 [26]。
喹诺酮类是易受紫外线辐射引起的化学修饰的化合物。在大多数情况下，这些光修饰产生非发光化学物质；然而，在某些条件下，暴露于紫外线辐射会产生新的发光化合物。虽然众所周知 Qs 在适当条件下经紫外线照射后表现出光诱导荧光 (PIF)，但其分析应用主要集中在产生的光产物上。具体来说，固定时间下的激发 - 发射荧光矩阵 (EEFMs) 已通过融合光化学反应前后测量的两组矩阵用于环境水样品中喹诺酮类的测定 [27]。在本研究中，使用实验室构建的反应器开发了一种基于 PIF 的新方法，专注于光诱导过程的动力学演化，以定量复杂样品（如可食用组织）中的喹诺酮类。这种方法不是获取单个固定终点的矩阵，而是通过在多个时间点收集激发 - 发射荧光矩阵来追踪光反应动力学，引入额外的判别模式。纳入这种动力学模式是生成三阶荧光数据的最既定策略之一。在化学或光化学反应过程中记录连续的 EEFMs 可产生互补的时间信息，增强系统选择性并能够解决严重重叠的分析信号，从而在保持二阶优势的同时提高分析性能 [28]。例如，EEFMs 结合动力学过程已成功应用于通过光降解测定血清中的叶酸衍生物 [29] 和水中的喹诺酮类 [20]；通过水解反应测定农药 [30]，[31]；通过 Fenton 降解测定水样品中的多环芳烃 [32]、食品接触塑料中的内分泌干扰化学品 [33] 以及可食用组织中的喹诺酮残留 [22]；以及涉及 PIF 策略的单一分析物 [21]，[34]。值得注意的是，通过降解反应纳入动力学过程增强了系统选择性；然而，由于发光信号的固有减少，它并未提高灵敏度。相比之下，光化学诱导荧光策略一致表明，整合时间模式可以同时增强选择性和灵敏度。最近，报道了一种基于 EEMs-PIF 的分析方法，用于定量经 QuEChERS 处理后的柠檬汁中无严重频谱重叠的多类农药 [35]。
然而，在本研究中提出的方法中，由于分析物属于同一化学家族，它们的光谱轮廓高度相似并表现出高模式共线性，这对算法提出了更具挑战性的要求。因此，本研究旨在开发一种分析方法，用于在复杂样品（可食用鸡组织）中使用最少的样品前处理来定量四种喹诺酮类：依诺沙星、沙拉沙星、马波沙星和达诺沙星 (Fig. 1)。这一目标通过分析在适当条件下获得的三阶数据 EEFM-照射时间来实现，使用灵活的潜在变量模型，具体为展开偏最小二乘法 (U-PLS) 结合残差三线性化 (RTL) 后校准程序，以利用二阶优势。
章节摘要
试剂和溶液
所有实验均使用高纯度级试剂并按原样使用。分析物购自以下来源：马波沙星 (MARBO) 和依诺沙星 (ENO) 购自 Fluka (德国 Seelze)，达诺沙星 (DANO) 和沙拉沙星 (SARA) 购自 Ri?del de H?en (德国)。无水磷酸氢二钠和磷酸二氢钠一水合物购自 Merck (德国 Darmstadt)。甲醇、乙腈和乙酸 (Sintorgan, 阿根廷) 为 HPLC 级。
影响 PIF 生成因素的评价
根据文献，当喹诺酮类受到紫外线辐射时，会发生显著的结构变化。主要的光解降解途径通过脱氟和脱烷基化，以及哌嗪环的氧化或取代发生 [43]，[44]。上述机制在不同程度上受到 pH 值、温度和溶剂介质变化的影响。因此，对这些变量的精确控制对于确保的可靠性至关重要
结论
本工作报道了激发 - 发射荧光 - 时间三阶数据的一种替代且有利的应用。该策略旨在同时定量四种表现出高度相似发光行为的兽用喹诺酮类。向激发 - 发射荧光矩阵中纳入额外的时间模式 (UV-PIF) 增强了方法的定量能力；由于时间轮廓在分析物之间差异显著，它们
CRediT 作者贡献声明
埃斯特班·罗梅罗: 撰写 – 初稿，验证，调查。胡安·A·阿兰西比亚: 撰写 – 审查与编辑，方法论，形式分析，概念化。加布里埃拉·A·伊巴涅斯: 撰写 – 审查与编辑，方法论，形式分析，概念化
竞争利益声明
? 作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作。
致谢
作者衷心感谢 罗萨里奥国立大学 (UNR, 项目 80020220700032UR 和 80020190300145UR)、国家科学研究和技术委员会 (CONICET, 项目 PIP 2021-3030)、国家科学和技术促进机构 (ANPCyT, 项目 PICT2020-00179) 和圣塔菲科学技术和创新机构 (ASaCTeI, 项目 PEIC I+D 2023-049) 对本工作的财政支持。E.R. 感谢 CONICET 提供博士奖学金。
埃斯特班·罗梅罗 | 胡安·A·阿兰西比亚 | 加布里埃拉·A·伊巴涅斯
罗萨里奥“埃德蒙多·A·鲁维达博士”化学研究所 (CONICET-UNR), 生物化学与药学科学学院，罗萨里奥国立大学，阿根廷罗萨里奥 Suipacha 531 街，邮编 2000
