简单高通量磁珠辅助液相色谱 - 串联质谱法在人血清中定量维生素 K1 和维生素 K2（甲萘醌 -4 和甲萘醌 -7）的开发与应用

《Talanta》：Development and application of a simple, high-throughput magnetic bead-assisted liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the quantification of vitamin K1 and vitamin K2 (menaquinone-4 and menaquinone-7) in human serum

　　

摘要

液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）已成为维生素 K 定量分析的首选方法，然而传统工作流程劳动强度大且难以规模化。我们开发并验证了一种简单、高通量的自动化磁珠辅助 LC-MS/MS 方法，依据临床实验室标准协会（CLSI）C62（第 2 版）指南，用于同时定量人血清中的维生素 K1（VK1）、甲萘醌 -4（MK-4）和甲萘醌 -7（MK-7）。该方法使用 MSi050/PLS 磁珠（5 mg/mL），通过甲醇加载和乙腈洗脱进行提取，仅需 100 μL 血清即可在 17 分钟内完成样本前处理。三条校准曲线在 0.20 至 10.00 ng/mL 范围内呈线性（r > 0.99），定量下限为 0.10 ng/mL。VK1、MK-4 和 MK-7 的总变异系数分别为 1.98% 至 3.54%、2.53% 至 3.73% 和 2.77% 至 4.59%。VK1、MK-4 和 MK-7 的回收率分别为 94.8% 至 112%、98.0% 至 113% 和 90.3% 至 106%。基质效应和残留均符合 CLSI 接受标准。由于维生素 K2 对光敏感，所有样本均在避光条件下处理。未提取样本在 -20°C 下稳定 14 天，提取后的样本在 4°C 下稳定 48 小时。此外，我们的方法应用于 245 名健康志愿者，以表征血清 VK 分布谱。通过结合自动化磁珠提取与快速 LC-MS/MS 检测，这种稳健策略显著提高了分析通量和重现性，同时保持了高准确性，为大规模临床维生素 K 评估提供了实用解决方案。

引言

维生素 K（VK）是一种必需脂溶性维生素，参与凝血、骨代谢和心血管健康 [1]。VK 家族包括叶绿醌（VK1）和一系列甲萘醌（MKs），其中 MK-4 和 MK-7 是临床研究中评估的主要形式，因为它们具有独特的组织分布和药代动力学特征 [2]，[3]。MK-4 部分来源于 VK1 的组织特异性转化，通过骨钙素γ-羧化促进骨形成 [4]，[5]，而 MK-7 富含于纳豆等发酵食品中，通过基质 Gla 蛋白活化抑制血管钙化 [6]。因此，准确区分 VK1、MK-4 和 MK-7 对于营养评估和疾病风险评估至关重要。

人血清中这三种分析物的定量面临相当大的技术挑战。内源性循环浓度本身较低：健康人群中 VK1 通常在 0.20-2.00 ng/mL 范围内 [7]，而未补充个体的 MK-4 通常保持在定量限附近或以下，据报道血清检出率低至 26% [8]。此外，它们的高脂溶性、光不稳定性以及与脂蛋白载体的紧密结合，要求从样本采集到提取的每个阶段进行严格控制 [9]。与大气压化学电离（APCI）联用的 LC-MS/MS 而非电喷雾电离（ESI）是维生素 K 同系物及相关异戊二烯醌的首选技术，因为其低极性限制了 ESI 响应，而它们对 APCI 蒸发的耐受性允许高效的气相化学电离。然而，富含脂质的血清基质导致明显的离子抑制和基质效应，从而损害准确性 [8]，[10]。现有的样本制备工作流程，包括蛋白质沉淀后接液 - 液萃取（LLE）使用己烷/乙酸乙酯系统或离线固相萃取（SPE）柱，仍然劳动密集，难以在不同操作者之间标准化，且难以扩展到大规模队列研究 [7]，[11]。

为了解决手动前端处理的瓶颈，自动化磁珠辅助提取（MBE）近期作为一种有前景的 LC-MS/MS 样本制备替代方案出现，实现与液体处理机器人集成的磁驱动结合 - 洗涤 - 洗脱循环 [12]，[13]。MBE 已被证明能有效减轻基质效应并在复杂血清背景下提供高回收率（例如胆汁酸分析）。然而，尚未开发出结合 MBE 样本制备同时定量 VK1、MK-4 和 MK-7 的方法。

在本研究中，我们开发并验证了一种高通量自动化且具成本效益的 MBE 工作流程，结合 LC-MS/MS 方法，用于人血清中 VK1、MK-4 和 MK-7 的同时准确定量。通过将功能化磁性颗粒整合到自动化提取平台中，我们实现了从人血清中高效且同步纯化三种目标 VK。应用该方法，在健康人群中发现维生素 K 组别在性别和年龄上的分布差异。我们的方法确保了 VK 的高效提取和定量，为维生素 K 缺乏或过量的早期诊断提供了可靠的分析工具。

章节摘要

人血清样本

所有样本均取自浙江省人民医院临床实验室进行的常规检测。为了方法验证，残留患者血清样本在采血后 6 小时内收集，立即储存在 -20 °C 并在 7 天内分析。所有涉及人类受试者的程序均按照浙江省人民医院伦理委员会的伦理标准进行（批准号 QT2024167）。

化学品和试剂

VK1、MK-4 和 MK-7

统计分析

使用 Microsoft Excel 进行数据整理和初步处理。统计分析使用 GraphPad Prism 10 版进行。连续变量对于正态分布数据表示为平均值±标准差，或非正态分布数据表示为中位数及四分位距。两组间的比较视情况使用独立样本 t-检验或非参数 Mann–Whitney U 检验进行。统计学显著性定义为 p<

MBE 方法的优化及代表性色谱分析

为提高分析灵敏度和准确性，我们系统地优化了关键参数，包括磁珠类型、磁珠用量和加载步骤中的甲醇浓度。在测试的功能化磁珠中，MSi050/PLS 磁珠捕获了最多的 VK 峰（图 2A）。MSi050/PLS 磁珠（Enriching Biotechnology）具有基于硅的基质（Fe₃O₄@SiO₂），功能化为苯基和吡咯烷酮基团，提供

讨论

准确测定血清维生素 K 代谢物对于临床评估维生素 K 营养状况至关重要。在本研究中，我们开发并验证了一种 MBE-LC-MS/MS 方法，用于同时定量 VK1、MK-4 和 MK-7，并将该方法应用于表征健康中国队列中这些分析物的人群分布。

LC-MS/MS 被广泛认为是维生素 K 定量的金标准，因为它提供了高灵敏度和特异性

结论

本研究建立了一种与 LC-MS/MS 耦合的高效自动化 MBE 方法，用于同时测定维生素 K1、MK-4 和 MK-7。维生素 K 分析要求特别高，因为这些分析物表现出复杂的理化性质，高度光敏，且容易产生明显的基质干扰。该方法侧重于通过完全在磁珠处理器内进行的简化工作流程，实现目标维生素的高效提取。

CRediT 作者贡献声明

Yanan Wang: 可视化，软件。 Lingli Yan: 验证。 Yangxiao Zhou: 监督。 Jun Xia: 写作 – 审查与编辑，项目管理，资金获取。 Yinglan Zhu: 写作 – 初稿，数据整理。 Yu Zhou: 方法论，概念化。 Jing Du: 方法论，概念化

未引用参考文献

[16]。

伦理批准及参与同意书

本研究经浙江省人民医院伦理委员会审查和批准（QT 2024167）。

数据和材料的可用性

数据和材料应要求提供。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

出版同意书

所有作者同意出版。

资金

本研究得到了中国浙江省重点 科技计划（编号 2025C01126）以及浙江省医疗和卫生科技计划（编号 2025KY565）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有任何已知的可能影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

朱英兰 | 周羽 | 杜静 | 王亚南 | 阎伶俐 | 周杨潇 | 夏军

浙江中医药大学，中国浙江杭州