牛育种计划越来越采用体外受精（IVF）和胚胎移植（ET）来加速遗传增益并更高效地扩繁优良遗传。在这些计划中，胚胎选择的优先级因育种目标而异[1], [2], [3]。种畜和终端父系计划可能优先选择具有高预测遗传价值的雄性胚胎，而奶用和替换畜导向的系统则可能更偏好具有强母性、生育力或生产性状的雌性胚胎，用于牛群替换、供体开发或未来产奶[4], [5], [6]。
一种偏向后代性别的方法是使用性别化精液，该方法通过流式细胞术根据X染色体和Y染色体精子约4%的DNA含量差异对精子进行分选[7], [8]。尽管性别化精液有效且已在奶牛系统中广泛采用，但其生产成本较高，且可能降低精子质量，据报道使用未分选精液的受胎率比使用性别化精液高10-30%[4], [7], [9]。这些局限性在体外受精和胚胎移植工作流程中尤为相关，因为在胚胎阶段进行选择可能比在受孕前尝试偏向性别提供更多灵活性。重要的是，胚胎水平的评估还可以将性别鉴定与更广泛的基因组评价相结合，而不仅仅依赖于通过精液选择传递的父系贡献[10]。
这为在育种流程中更早、更精确地做出选择决策创造了机会。在移植前确定胚胎性别和遗传价值的能力可以在投入受体能力和其他高成本资源之前增加选择强度。将性别鉴定整合到基于基因型的选择（包括估计育种值（EBV）或其他预测价值估计）上游，将使育种计划能够仅推进最符合其生产目标的胚胎[10], [11]。图1显示了一种胚胎性别和基因型确定的示例工作流程，其中基于性别的早期分类减少了进入下游基因分型、移植及相关资源密集型步骤的胚胎数量。
目前的胚胎性别鉴定和基因分型工作流程仍然在后勤方面要求较高。在许多计划中，所有胚胎都会被活检并冷冻保存，而活检材料通常需要在干冰中运输到实验室进行分析以保护样本完整性[12], [13]。尽管基于PCR的胚胎性别鉴定在仅需性别鉴定时有效，且单核苷酸多态性（SNP）微阵列在基因分型方面已经成熟，但与胚胎活检、冷冻保存、样本处理和运输相关的要求增加了整体选择工作流程的成本、人力和延误[10], [14], [15]。它们还可能受到一些服务提供商不直接接受胚胎活检样本作为性别鉴定或基因分型检测输入的限制[16]。
因此，一种简单、灵敏、准确且低资源的、与胚胎实验室兼容的胚胎性别鉴定方法，将提供一个实用的分类点，可在冷冻保存、移植或基因分型之前进行筛选[17], [18], [19]。在仅需性别的流程中，胚胎可以直接选择进行移植而无需冷冻保存。如果需要下游基因分型和EBV预测，早期性别鉴定可以将冷冻保存和SNP微阵列送检数量限制在所需性别的胚胎上，减少不必要的处理和相关成本，提高胚胎水平分子选择的效率。
等温扩增结合CRISPR伴随切割为在田间或近田间环境中进行快速、低资源的基于DNA的性别鉴定提供了一条有前途的途径[16], [20], [21]。此前已报道了基于重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（LAMP）的牛胚胎性别鉴定方法，包括依赖非特异性染料介导或浊度检测扩增的双链DNA（dsDNA）的方法[18], [19]。然而，基于dsDNA的读出可能容易受到非特异性扩增产生的信号影响，且无法提供自信决策所需的序列水平特异性[22], [23]。相比之下，将RPA与CRISPR-Cas12a（Cas12a）检测相结合增加了一个可编程的、序列特异性的检测步骤，在保持等温工作流程速度和简单性的同时提高了分析信心[16], [24]。
在本研究中，我们开发了一种低资源的单管RPA-Cas12a检测方法，用于靶向Y染色体S4重复序列的牛胚胎性别鉴定，这是一种高拷贝的Y连锁元件，适合敏感的雄性特异性检测。该工作流程在RPA-Cas12a上游整合了快速全基因组扩增（WGA），以提高从低输入囊胚活检材料中的检测性能，同时产生足够的DNA用于下游SNP微阵列基因分型。
我们使用系列稀释的牛基因组DNA（gDNA）评估检测方法性能，并评估了在主要肉牛品种和荷斯坦牛中的雄性特异性检测，结果与已建立的实时PCR熔解曲线检测方法进行了比较[25]。整合后的工作流程随后在从牛囊胚活检产生的WGA产品上进行了测试。性别判断通过实时PCR熔解曲线分析确认，并独立使用GeneSeek基因组分析器（GGP）牛100K SNP微阵列进行评估，这也使得能够对WGA方案用于基于基因型信息的胚胎选择进行评估。
