《Frontiers in Biophysics》：Recent advances in mass spectrometry methods for the investigation of oligomeric intermediates of amyloid protein aggregation
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摘要：淀粉样蛋白是许多无法治愈疾病的病因学因素。虽然淀粉样纤维的结构表征进展迅速，但由于寡聚中间体的瞬时性和动态性，对其了解相对滞后。用于结构生物学的质谱方法正在快速发展。本文总结并讨论了近5年来最相关的应用，重点关注不同方法捕获淀粉样蛋白寡聚状态的特定潜力。
摘要：淀粉样蛋白是许多无法治愈疾病的病因学因素。虽然淀粉样纤维的结构表征进展迅速，但由于寡聚中间体的瞬时性和动态性，对其了解相对滞后。用于结构生物学的质谱方法正在快速发展。本文总结并讨论了近5年来最相关的应用，重点关注不同方法捕获淀粉样蛋白寡聚状态的特定潜力。
1 引言
蛋白质错误折叠并聚集为淀粉样结构，是几乎所有蛋白质正常折叠过程的竞争途径。该过程导致纤维积累，其中单体堆积成β-丰富结构，并具有不同程度的构象紊乱。淀粉样结构既具有生理相关性，也与退行性疾病相关，如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。聚集过程涉及寡聚结构，这些结构可通过初级或次级成核步骤形成，并代表通路内或脱靶中间体。由于寡聚中间体的动态性和异质性，其结构仍难以捉摸。然而，对其表征有助于阐明聚集机制并揭示治疗策略的潜在靶点。除被认定为毒性物种外，它们还可能携带涉及同一蛋白在不同疾病中的“菌株”结构决定因素，并可作为“类朊病毒”传播中的种子，在该过程中，聚集蛋白的正常折叠分子被招募到致病机制中。因此，寡聚状态可以揭示导致给定淀粉样蛋白相关不同病理的不同聚集途径。
质谱（MS）已成为结构生物学的核心工具。其独特优势在于通过MS分析固有的离子分选机制，将异质样品分解为亚群，从而为每个检测到的离子提供可测量参数。目前已有整类方法用于蛋白质结构研究，统称为结构质谱。一种方法是所谓的天然MS，其分析完整蛋白质和超分子复合物，同时保持负责折叠和结合的非共价相互作用。电喷雾电离（ESI）获得的电荷态分布（CSD）反映蛋白质致密性，而质量则反映结合和修饰。气相离子的形状可通过离子迁移（IM）探索，其测量旋转平均碰撞截面（CCS）。另一类方法基于溶液中蛋白质的构象敏感共价修饰（足迹法），随后通过自下而上或自上而下的MS分析反应产物。已使用多种修饰策略，包括交联（XL）、氢-氘交换（HDX）、快速光化学氧化（FPOP）、共价蛋白绘画（CPP）和有限蛋白水解（LIP）。
这类方法有助于解构动态结构集合，通过平衡或时间分辨测量，克服整体平均效应。此外，这些方法可与常规MS方案结合，以表征每个解构结构物种上的翻译后修饰和突变。然而，结构MS无法实现原子分辨率，并且可能存在构象重排以及缓冲液组成和蛋白质浓度方面的限制。尽管如此，这些方法的适用性正在迅速发展。它们通常与硫黄素-T荧光（用于聚集动力学）、小角X射线散射（SAXS）或核磁共振（NMR）（用于尺寸分布）、NMR和计算模拟（用于原子分辨率建模）结合使用。天然MS方法还补充了原子力显微镜（AFM）、透射和低温电子显微镜（cryo-EM）及断层扫描（cryo-ET）成像。本工作强调了结构MS在将异质和动态系统解构为结构注释的亚群，并为计算建模提供约束方面的具体贡献。重点集中在近5年来淀粉样蛋白寡聚中间体的研究。
2 淀粉样β
AD的一个标志是淀粉样β（Aβ）肽的聚集，该肽由淀粉样前体蛋白（APP）经β-和γ-分泌酶切割产生。Aβ40和Aβ42是最常研究的变体，但Aβ43也参与病理，所有这些片段都在AD脑中积累。Aβ42和Aβ43比Aβ40具有更强的聚集倾向和更高的细胞毒性。天然IM-MS已用于比较同源和异源寡聚体。该研究表明，Aβ40二聚体和三聚体具有双峰CCS分布，揭示了大量延伸寡聚体与较紧凑组分共存。相反，Aβ42和Aβ43缺乏二聚体和三聚体的延伸群体。有趣的是，Aβ40与Aβ42或Aβ43的杂交二聚体和三聚体具有与纯Aβ42和Aβ43相似的CCS谱，其中延伸群体被耗尽。因此，Aβ42和Aβ43能够将寡聚结构重塑为更紧凑的状态。考虑到它们对Aβ40聚集动力学的刺激作用，建议更紧凑的寡聚体具有更高的聚集倾向，从而为Aβ变体的相互影响提供机制解释。天然IM-MS还检测到Aβ25-35肽的六聚体cylindrin状态，该状态代表能够插入膜中的推定毒性形式。
循环离子迁移（cIM）技术提供了进一步改进，通过多次离子循环增强灵敏度和分辨率，放大到达时间差异。一项关于Aβ42寡聚体的精确方法学工作为cIM应用于淀粉样寡聚体奠定了基础，分析了仪器参数的影响。研究表明，在优化实验设置后，可以检测到高达十二聚体的Aβ42寡聚体，同时最小化解离和变性。通过碰撞诱导解折叠（CIU）的气相解折叠突出了三聚体相对于二聚体具有更高的稳定性以及不同的解折叠途径。
cIM也已应用于研究通过交联Aβ片段（对应残基17-36或16-36）获得的共价同源三聚体组成的合成种子。该区域跨越中央和C末端区域，这些区域最参与聚集。每个三聚体通过额外的共价键（将N-和C-末端钉合在一起）被约束在β-发夹构象中，如成熟纤维外层所观察到的。这些三角形种子可以结合成更高阶结构，为模拟Aβ42早期组装提供了潜在有用的工具。
通过甘氨酸乙酯（GEE）足迹法利用羧基残基烷基化来研究Aβ42寡聚化的早期阶段。结果与中央和C末端区域参与聚集过程一致，而N-末端大多保持暴露。动力学建模识别出四个群体，它们依次作为后续聚集步骤的种子：小寡聚体首先组装（M1），并通过不可逆的结构重排转化为次级种子（M2）。M2种子生长为原纤维（M3），最终成为成熟纤维（M4）。
3 α-突触核蛋白
突触前蛋白α-突触核蛋白（α-syn）的聚集在PD和其他突触核蛋白病的病因学中起核心作用。野生型蛋白参与散发性疾病，而突变体与家族性PD相关。已识别出三个不同的蛋白区域：一个能够形成α-螺旋、与膜相互作用并承载大多数致病突变的N-末端区域，一个驱动聚集的中央区域（非淀粉样组分，NAC区域），以及一个主要参与与其他蛋白质相互作用的酸性C-末端区域。未经预孵育的wt α-syn的天然MS谱通常显示单体形式占主导，以及非常少量的寡聚体。然而，已表明一种在大肠杆菌中表达时积累的N-末端截短形式显示出五聚体、六聚体和七聚体的主要信号，表明更快的聚集动力学。这些研究补充了越来越多的证据，暗示C-和N-末端α-syn截短在PD发病机制中的作用。该研究使用了通常与ESI不兼容的含Tris和NaCl的溶液，这得益于亚微米发射器，扩展了可探索条件的范围。
α-Syn寡聚体也通过IM-MS研究，以响应活性氧（ROS）引起的蛋白质氧化，这已被认为与发病机制有关。通过低温等离子体（LTP）处理实现受控氧化，利用超快蛋白质修饰（微秒至毫秒时间尺度）。修饰后的自下而上LC-MS/MS分析表明，2-8分钟孵育后的氧化优先修饰单体α-syn的C-末端区域（特别是M116、M127和Y133）。结果与该蛋白在中性pH下最无序部分一致，并指出LTP处理可作为有效的构象探针，此外还有更常用的FPOP。未处理α-syn的天然IM-MS可检测到明显的寡聚体，包括二聚体、三聚体和四聚体。增加处理时间（2-8分钟）导致α-syn寡聚体逐渐丢失，特别是三聚体和四聚体，表明修饰蛋白的寡聚化倾向较低。圆二色分析表明，C-末端α-syn氧化阻碍β-折叠形成。LTP氧化的α-syn也显示出较低的纤维形成倾向和降低的细胞毒性，而预成型纤维的氧化并不减轻毒性。这一结果表明α-syn氧化与致病机制之间存在复杂关系，并需要与关于氧化应激在神经退行性变中作用的现有证据相协调。
HDX是结构MS中广泛使用的方法。它基于酰胺氢与周围D2O（或反之）中氘的交换。氢键或溶剂屏蔽保护免受交换，导致较低的同位素掺入。由于交换影响质量，除NMR外，已开发用于MS分析反应产物的方法和软件。每个残基都具有信息性，无论其化学结构如何。HDX-MS已描述了表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）对大型α-syn寡聚体（约23个亚基及其倍数）的影响。结果显示EGCG对N-末端的选择性保护，表明稳定了闭合构象。同时，EGCG诱导同一区域中甲硫氨酸残基的氧化，该区域在氧化后显得高度无序。由于无序且未修饰的N-末端似乎介导与膜的相互作用和毒性，这些效应可能是EGCG保护作用的基础。
HDX也已用于研究白藜芦醇对α-syn寡聚化的干扰。沿聚集过程的脉冲标记显示白藜芦醇的抑制作用，特别是在跨越NAC区域的肽上。在白藜芦醇存在下聚集仍会进行，但交换模式表明寡聚结构向更开放的结构重塑。
XL-MS在结构MS中扮演着相当独特的角色。含有两个反应基团、间距确定的试剂用于交联特定蛋白质官能团。通过自下而上或自上而下MS进行产物分析得出交联位点之间距离的上限。因此，交联剂充当化学尺子来研究蛋白质结构、动力学和相互作用。在这个意义上，XL-MS类似于FRET或NOE-NMR实验，提供可用于计算建模的距离约束。XL-MS已应用于研究与膜模拟物结合的α-syn寡聚体，揭示了两种结构（线性和环形）从α-syn二聚体发展而来，取决于两个亚基的相对取向。即使是低浓度的二期药物UCB0599也会导致膜结合寡聚体的重排，改变二聚体界面处的交联模式。这些结果为药物特异性靶向α-syn寡聚体提供了结构见解。类似地，XL-MS已用于绘制α-syn大型寡聚体（约30个亚基）与PSMa3（一种已知消除寡聚体毒性并抑制转化为纤维的肽）之间的相互作用。检测到四个交联，全部位于α-syn N-末端区域（残基1-61）。HDX测量提供了一致的保护模式，并表明PSMa3结合位点在寡聚状态下仍可及。该区域可能代表治疗策略的一个有趣的结构靶点。
NAC区域的聚集行为也已使用对应于α-syn残基68-78（NAC区域中的PD1肽）和残基47-56（N-末端区域中的PD2肽）的合成肽进行研究。这些研究是在最近开发的将IM-MS与红外多光子解离（IRMPD）光谱相结合的混合仪器上进行的。由于MS不直接提供蛋白质二级结构信息，对IM-MS解析的亚群进行光谱构象分析的可能性极具吸引力。尽管CCS值非常相似，酰胺A带显示PD1二聚体形成反平行β结构，而PD2二聚体包含平行β-折叠。G51D致病变体的二聚体保持与单体相似的螺旋构象。后一种二聚体结构也更紧凑和稳定，基于对IRMPD离子加热的抵抗性。
4 转甲状腺素蛋白
直接电荷检测质谱（CDMS）的最新技术进步克服了电荷评估和质量计算中对解卷积程序或同位素分辨率的需求，使得异质和高质量组装体（如高阶蛋白质寡聚体）的分析成为可能。IM-MS与CDMS结合已用于研究转甲状腺素蛋白（TTR）的错误折叠和聚集。该蛋白质负责血液和脑脊液中甲状腺素和视黄醇的生理运输。其聚集与老年性系统性淀粉样变性有关。TTR天然为四聚体，聚集由四聚体解离和单体错误折叠触发，随后重新结合成高阶寡聚体并最终形成纤维。寡聚化作为pH、预孵育温度和序列变体的函数被探索。IM-MS显示在酸性pH下延伸单体积累，致病突变L55P增强了这一现象。同时，CDMS显示酸性pH、低温和L55P突变诱导异质和更高阶的寡聚体（检测到多达19个亚基）。相反，在不太有利于聚集的pH和温度条件下，wt TTR中以八聚体为主，与天然样四聚体的结合一致。聚集的温度依赖性表明水合作用的作用，通过变温ESI和D2O效应的进一步分析支持。此外，HDX-MS可以定位“冷”水分子，这些水分子与本体溶剂的交换受到与蛋白质结构相互作用的抑制，位于二聚体/二聚体界面，并显示它们负责稳定天然四聚体。
5 TDP-43
TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是肌萎缩侧索硬化（ALS）新兴治疗策略的靶点。其寡聚化已通过IM-MS研究，也与Aβ肽相互作用，揭示了相互影响。此外，TDP-43307?319的毒性六聚体cylindrin状态的形成可以通过IM-MS监测，测试药物效果并识别有前景的抑制剂。还探索了突变和蛋白质浓度的影响，识别出导致纤维或cylindrin的双重动力学聚集途径，并为毒性表型提供解释。
6 其他淀粉样系统
天然IM-MS也已用于研究肽的寡聚化（无论是设计的还是代表淀粉样蛋白不同区域的肽），评估突变和条件对尺寸分布和稳定性的影响。此外，它已被用于探索二硫键重排对胰岛素聚集途径的影响。治疗性肽利拉鲁肽的高阶寡聚体已通过CDMS检测，揭示了一种双重聚集途径。
XL-MS已应用于β2微球蛋白（负责透析相关淀粉样变性）聚集早期阶段的研究。通过光诱导交联产生了脱靶共价二聚体，并显示其抑制未修饰蛋白的聚集。
HDX-MS已应用于胰岛素β链、胰高血糖素类似肽和tau蛋白聚集途径中寡聚中间体的结构表征。在后一种情况下，通过将寡聚体结构与纤维形态联系起来，可以表明由聚集条件引起的多态性在聚集早期阶段就已印记。
胰岛淀粉样多肽（IAPP）是一种多肽激素，在胰岛中聚集，导致2型糖尿病中的β细胞功能障碍，并与胰岛素和Aβ显示出病理生理联系。结构MS早已应用于IAPP寡聚中间体的研究。在假定的毒性机制中，IAPP与膜的相互作用起关键作用。这些相互作用最近通过结合纳米盘的IAPP的天然MS进行研究，纳米盘是由脂质双层周围环绕支架蛋白带组成的膜模拟物。结合纳米盘的宿主蛋白的寡聚化可以通过原始nMS谱的质量缺陷分析来评估。该方法表明，人IAPP在纳米盘环境中形成四聚体，而非淀粉样变性大鼠变体则顺序结合且仅达到2:1化学计量。非淀粉样变性猪蛋白则表现出另一种行为，完全不结合。这些实验为进一步的机制研究和抑制剂筛选奠定了基础。
7 未来展望
结构MS的两个强大工具尚未应用于淀粉样寡聚体的研究，即偶联质谱的有限蛋白水解（LiP-MS）和共价蛋白绘画（CPP）。这些方法分别通过酶蛋白水解和同位素编码化学甲基化来探测局部溶剂可及性和构象动力学。下游定量的自下而上MS生成原始结构的指纹图谱，具有关于溶剂暴露程度的位点特异性信息。这些方法已应用于淀粉样纤维的结构研究，例如α-syn和Aβ40/Aβ42，表征了替代多态性，以及单体和纤维状α-syn，识别了线粒体相互作用物。未来将这些方法扩展到寡聚结构具有高度前景。已表明对蛋白水解的敏感性可以区分α-syn和tau寡聚体的稳定性和形态。
细胞内的蛋白质淀粉样聚集由液-液相分离（LLPS）促进，这是一个具有复杂生理和病理意义的过程。XL-MS已成功应用于LLPS“液滴”内α-syn的表征，显示延伸构象体的积累。通过这种和其他基于MS的技术捕获在LLPS条件下形成的淀粉样蛋白寡聚物种将非常重要。
一个主要前沿在于MS与人工智能（AI）的整合，例如促进自动化特征提取、谱图解卷积和定量分析。基于AI的工具，如AlphaFold，可以与结构MS结合，例如使用来自XL-MS的距离约束，来模拟动态大分子组装体以及非天然或自缔合淀粉样结构。此外，将结构MS与cryo-EM和cryo-ET相结合的混合工作流为整合结构表征提供了非凡的协同作用。单颗粒cryo-EM与结构MS的结合可以捕获传统结构测定难以捉摸的瞬时或低丰度物种。
结构MS的不同方法越来越多地在外体（ex-vivo）中实施，XL-MS也在体内（in-vivo）看到了适用性。天然环境质谱（NAMS）方法正在迅速发展，为组织来源和患者来源的寡聚体分析铺平了道路。这一方向的未来发展将为理解淀粉样生物学和淀粉样疾病做出重要贡献。这些方法也有潜力达到组学规模和时间分辨实施，为淀粉样结构生物学开辟了令人兴奋的新视角，不仅通过辅助药物发现和阐明聚集机制，还有助于发现新型生物标志物和理解对蛋白质聚集的生物学反应。
