《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Diagnostic accuracy of recombinase polymerase amplification-based assays for mosquito-borne virus detection in clinical samples: a systematic review and meta-analysis
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背景： 蚊媒病毒性疾病因其频繁暴发、相似的早期临床表现以及快速传播的潜力，对公共卫生构成了重要威胁。病毒分离、血清学检测和RT-qPCR等常规诊断方法虽然可靠，但可能受限于周转时间长、交叉反应、实验室设备要求以及操作人员培训等因素。基于重组酶聚合酶扩增（RPA
背景： 蚊媒病毒性疾病因其频繁暴发、相似的早期临床表现以及快速传播的潜力，对公共卫生构成了重要威胁。病毒分离、血清学检测和RT-qPCR等常规诊断方法虽然可靠，但可能受限于周转时间长、交叉反应、实验室设备要求以及操作人员培训等因素。基于重组酶聚合酶扩增（RPA）的方法已成为快速检测蚊媒病毒的有前景的工具，但其总体诊断准确性仍需全面评估。本Meta分析旨在系统评价RPA检测蚊媒病毒的诊断性能。
方法： 研究人员对PubMed、Embase、Web of Science、Scopus和MEDLINE进行了系统检索，检索词涉及蚊媒病毒、RPA技术和诊断准确性。纳入报告灵敏度（sensitivity）和特异度（specificity）或提供足够数据以构建2 × 2列联表的研究。采用QUADAS-2工具评估纳入研究的方法学质量。使用R软件进行统计分析。应用贝叶斯双变量随机效应模型（Bayesian bivariate random-effects model）计算合并灵敏度、特异度、阳性似然比（positive likelihood ratio, PLR）、阴性似然比（negative likelihood ratio, NLR）和汇总受试者工作特征（summary receiver operating characteristic, SROC）曲线。
结果： 本Meta分析共纳入10项研究，涉及13个数据集。RPA检测的合并灵敏度和特异度分别为0.96（95% CrI: 0.92–0.98）和0.99（95% CrI: 0.98–1.00）。合并PLR为146.25（95% CrI: 35.79–597.57），合并NLR为0.05（95% CrI: 0.02–0.10）。SROC曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.987（95% CrI: 0.972–0.995），提示总体诊断性能优异。亚组分析显示，在基于CRISPR和非CRISPR组，以及DENV和非DENV亚组中，RPA检测均保持了良好的诊断准确性。Deeks’漏斗图不对称检验未检测到显著的发表偏倚。
结论： RPA检测在蚊媒病毒检测中显示出良好的诊断准确性，具有较高的合并灵敏度、特异度和AUC。这些发现提示，RPA方法可能为快速病例识别和公共卫生应对提供有用的技术选择。然而，纳入研究数量有限、方法学局限以及真实世界证据不足，仍需谨慎解读。仍需要更多高质量的前瞻性研究来确认其在临床和公共卫生环境中的实际可行性和应用价值。
系统评价注册： https://www.crd.york.ac.uk/prospero/，标识号CRD420261380107。
检索策略
本系统评价和诊断试验准确性Meta分析依据PRISMA-DTA声明进行实施和报告。研究方案已在PROSPERO注册（CRD420261380107）。总体而言，评价过程遵循注册方案，未对主要研究问题、纳入标准、待评价试验（index test）、参考标准（reference standard）或主要诊断结局做出更改。
研究人员在PubMed、Embase、Web of Science、Scopus和MEDLINE中进行了系统文献检索，以识别关于蚊媒病毒感染的RPA诊断试验的合格研究。检索词由与蚊媒病毒、RPA技术和诊断准确性相关的关键词组合构建，包括：（“Dengue” OR “Zika” OR “West Nile” OR “Yellow fever” OR “Japanese encephalitis” OR “Chikungunya” OR “mosquito-borne virus” OR “arbovirus”）、（“recombinase polymerase amplification” OR “RPA” OR “RT-RPA” OR “reverse transcription recombinase polymerase” OR “recombinase polymerase”）以及（“diagnose*” OR “sensitivity” OR “specificity” OR “clinical” OR “validation” OR “accuracy”）。所有检索到的记录均导入NoteExpress软件进行文献管理和去重。
纳入与排除标准
基于PICOS框架，研究符合纳入标准需满足以下条件：（1）研究对象（Population, P）：疑似蚊媒病毒感染的临床标本或样本，包括登革病毒、寨卡病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒或其他蚊媒病毒；（2）待评价试验（Index test, I）：基于重组酶聚合酶扩增的检测方法，包括RPA、RT-RPA或相关的逆转录RPA平台；（3）对照（Comparator, C）：常规参考或对照方法，如RT-qPCR、常规PCR、病毒分离、血清学检测或其他已建立的诊断方法；（4）结局（Outcomes, O）：报告诊断准确性结局（包括灵敏度和特异度）或提供足够数据以构建2 × 2列联表的研究；（5）研究设计（Study design, S）：涉及临床样本的诊断准确性研究或技术验证研究。排除综述、会议摘要、病例报告、社论、信件、仅动物研究以及无可提取诊断准确性数据的研究。
数据提取与质量评估
两名研究人员使用预先设计的Excel表格独立提取以下信息：第一作者、发表年份、国家、研究设计、样本类型、参考标准、检测类型、CRISPR/Cas类型（如适用）、真阳性（TP）、假阳性（FP）、假阴性（FN）和真阴性（TN）。对于使用不同引物组、靶序列和非重叠样本报告不同病毒血清型独立诊断结果的研究，每个符合条件的2 × 2表均作为独立数据集提取。数据提取过程中的分歧通过讨论解决。使用QUADAS-2工具评估纳入研究的方法学质量。偏倚风险在四个领域进行评估：患者选择、待评价试验、参考标准以及流程与时间。适用性关注在三个领域进行评估：患者选择、待评价试验和参考标准。每个领域根据原始研究报告的信息判定为“低”、“高”或“不清楚”。使用Review Manager 5.4.0生成质量评估图。
统计分析
统计分析使用R软件（版本4.5.2）进行。采用meta4diag软件包中实现的贝叶斯双变量随机效应模型来估计合并灵敏度、特异度、阳性似然比（PLR）和阴性似然比（NLR），及其相应的95%可信区间（CrIs）。生成汇总受试者工作特征（SROC）曲线和十字准线图以评估总体诊断性能。通过计算灵敏度与假阳性率之间的Spearman相关系数以及目视检查SROC曲线来评估阈值效应。异质性通过灵敏度的齐性检验以及基于诊断比值比（diagnostic odds ratio, DOR）的Cochran’s Q检验和I2统计量进行评估。还报告了各灵敏度与特异度估计值的变异性。这些分析使用mada软件包进行。采用留一法进行敏感性分析以评估结果的稳健性。此外，为评估同一研究多个数据集的潜在影响，还进行了一项额外的保守敏感性分析，即每次仅保留Zhong_2025的一个血清型特异性数据集，并移除其他三个。基于似然比，使用Fagan列线图评估临床适用性。发表偏倚通过加权线性回归实现的Deeks’漏斗图不对称检验进行评估。所有图形均使用R生成。
文献筛选过程
通过系统数据库检索共识别出444条记录，包括PubMed（43条）、Embase（56条）、Web of Science（100条）、Scopus（212条）和MEDLINE（33条）。未通过其他来源识别到额外记录。去重后剩余242条记录进行标题和摘要筛选。其中210条记录因与研究问题无关、不涉及蚊媒病毒诊断、未评价基于重组酶聚合酶扩增的检测方法或缺乏诊断准确性信息而被排除。
随后对32篇潜在合格文章的全文进行评估。22篇文章因以下原因被排除：9篇未包含临床样本验证，1篇全文无法获取，1篇使用了与另一项合格研究相同的数据集，11篇未提供足够数据以构建2 × 2列联表。最终，10项研究被纳入定量综合和Meta分析。
纳入研究的特征
从10篇文章中共提取13个数据集。纳入研究发表于2015年至2026年间，并在不同国家或地区开展，包括马来西亚、中国、英国、泰国、印度、美国/巴西/洪都拉斯、塞内加尔和巴西。目标病毒包括登革病毒、寨卡病毒、西尼罗病毒和基孔肯雅病毒。样本类型主要包括血清、血浆、尿液、全血、精液和混合临床标本。所有纳入研究均使用qPCR或RT-qPCR作为参考标准。在13个提取的数据集中，6个评估了不含CRISPR/Cas组件的RT-RPA检测，7个评估了RPA与CRISPR/Cas系统联合的检测。提取的诊断数据包括TP、FP、FN和TN，用于构建2 × 2列联表进行定量分析。
质量评价
在患者选择领域，4项研究因未避免病例对照设计或使用了选择性验证样本而被认为具有高偏倚风险，5项研究因未明确报告样本是否连续或随机入组而存在不清楚的偏倚风险。对于待评价试验，9项研究被判定为存在不清楚的偏倚风险，主要原因是未明确说明待评价试验结果的判读是否在不知晓参考标准结果的情况下进行。在参考标准领域，所有纳入研究均被认为具有低偏倚风险，因为使用了RT-qPCR或实时RT-PCR作为参考方法。关于流程与时间，1项研究因检测流程信息不足而存在不清楚的偏倚风险，其余研究被判定为低风险。对于适用性关注，大多数研究在待评价试验和参考标准领域表现出低关注度，而3项研究因使用选择性样本组或混合验证样本而在患者选择方面存在不清楚的关注度。
发表偏倚
发表偏倚和小研究效应主要使用Deeks’漏斗图不对称检验进行评估。未检测到显著的小研究效应（斜率 = ?2.303，p = 0.861）。Deeks’漏斗图的目视检查也未显示明显不对称。此外，基于log(DOR)对sd(LDOR)的常规漏斗图用于视觉参考，显示纳入研究总体呈对称分布。
总体诊断准确性
纳入数据集的合并灵敏度为0.96（95% CrI: 0.92–0.98），合并特异度为0.99（95% CrI: 0.98–1.00）。合并阳性似然比（LR+）为146.25（95% CrI: 35.79–597.57），合并阴性似然比（LR?）为0.05（95% CrI: 0.02–0.10）。在各数据集中，灵敏度估计值范围为0.77至1.00，特异度估计值范围为0.94至1.00。各研究的LR+值差异较大，而大多数纳入研究的LR?值保持在较低水平。
SROC曲线与十字准线图
SROC曲线总结了纳入研究间灵敏度与特异度之间的权衡，曲线下面积（AUC）为0.987（95% CrI: 0.972–0.995）。同时，在十字准线图中，每项研究用一个点表示，水平和垂直线分别表示特异度和灵敏度的相应95%置信区间。大多数研究分布在ROC空间的左上区域，对应高灵敏度和低1?特异度。置信区间的分布因研究而异，部分研究在灵敏度或特异度方面显示出较宽的区间。
敏感性分析
为进一步检验本研究结果的稳健性，采用留一法进行了敏感性分析。结果显示，每次排除一个单独数据集后，合并灵敏度、合并特异度、阳性似然比（PLR）、阴性似然比（NLR）和诊断比值比（DOR）均无明显波动。合并灵敏度范围为0.946至0.962，合并特异度范围为0.989至0.993，PLR范围为86.000至137.286，NLR范围为0.038至0.055，DOR范围为1575.074至3495.505。这些结果表明本研究的总体结果未受任何单一数据集的过度影响，结论相对稳健。此外，考虑到从Zhong_2025中提取了四个血清型特异性数据集，研究人员进一步进行了一项额外的保守敏感性分析，即每次仅保留这四个数据集中的一个并移除其他三个。在此分析中，每次纳入10个数据集。合并灵敏度范围为0.948至0.957，合并特异度范围为0.996至0.997，与主要分析接近。这些结果表明总体结论并非主要由Zhong_2025驱动。
阈值效应与异质性
使用mada软件包评估阈值效应。灵敏度与假阳性率之间的相关系数为0.018，提示无明显阈值效应。此外，SROC曲线未显示典型的“肩臂”模式，进一步支持不存在明显阈值效应。随后，进一步评估纳入数据集间的异质性。灵敏度的齐性检验显示数据集间存在显著异质性（χ2 = 32.061, df = 12, p = 0.001）。事实上，各灵敏度估计值范围为0.77至1.00，各特异度估计值范围为0.94至1.00，表明纳入数据集间存在变异性。在基于DOR的异质性分析中，未检测到显著异质性，Cochran’s Q = 11.661，df = 12，p = 0.473，Higgins’ I2 = 0%。log诊断比值比的森林图也直观地支持了这一结果，显示各数据集的合并估计值相对稳定。然而，由于DOR将灵敏度和特异度合并为单一指标，该结果被视为补充性证据，不能排除灵敏度观察到的变异性。因此，尽管基于DOR未观察到明显异质性，合并诊断估计值仍应谨慎解读。
临床适用性
Fagan列线图显示，在检测前概率为50%时，当合并阳性似然比（LR+）为146.25时，阳性检测结果将患病概率提高至约99.20%；而当合并阴性似然比（LR?）为0.05时，阴性检测结果将患病概率降低至约5%。
亚组分析
在按检测平台分层的亚组分析中，CRISPR组纳入7个数据集，非CRISPR组纳入6个数据集。CRISPR组的合并灵敏度为0.971（95% CrI: 0.943–0.989），高于非CRISPR组（0.918，95% CrI: 0.852–0.969）。相反，非CRISPR组的合并特异度为0.997（95% CrI: 0.989–1.000），略高于CRISPR组（0.985，95% CrI: 0.963–0.997）。这些结果显示纳入数据集中CRISPR组与非CRISPR组之间存在数值差异。然而，该亚组分析属于探索性分析，不应被解读为直接的比较性证据，因为数据集数量有限，且病毒类型、样本类型和研究设计等潜在混杂因素无法完全控制。研究人员进一步基于病毒类型（DENV和非DENV亚组）进行了亚组分析，两个亚组均表现出较高的总体诊断性能。DENV亚组的合并灵敏度为0.954（95% CrI: 0.904–0.986），合并特异度为0.982（95% CrI: 0.969–0.992）。非DENV亚组的合并灵敏度为0.955（95% CrI: 0.899–0.987），合并特异度为1.000。总体而言，DENV和非DENV亚组显示出相似的合并灵敏度，而非DENV亚组具有更高的合并特异度。然而，由于非DENV亚组中的多个数据集报告了零假阳性，该亚组的特异度估计值表现出边界聚集现象，应谨慎解读。
