HMOX1介导的铁死亡参与了奶山羊的坏疽性乳腺炎的发生

《The Veterinary Journal》：HMOX1-mediated ferroptosis participates in gangrenous mastitis in dairy goats

　　

摘要

坏疽性乳腺炎是一种由细菌感染引起的严重疾病，可能导致受感染的山羊出现败血症甚至死亡，对奶山羊产业的发展构成重大威胁。目前对该疾病的发病机制尚未完全了解。在本研究中，我们从一只患有坏疽性乳腺炎的山羊身上分离出金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），并利用其建立了体内（in vivo）和体外（in vitro）模型。通过组学测序以及检测铁（iron）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）的水平，结合实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot技术，评估了铁死亡现象（ferroptosis）的发生情况。此外，我们使用铁死亡抑制剂Fer-1（Fer-1）、抑制HMOX1的siRNA和线粒体分裂抑制剂Mdivi-1，探讨了HMOX1在调控铁死亡和炎症反应中的作用，以及其与自噬（mitophagy）的关联。研究结果表明，坏疽性乳腺炎模型具有典型症状，包括乳腺组织发绀和乳汁带血。基因集合富集分析（GSEA）显示铁死亡途径相关基因显著富集，其中HMOX1是差异表达最显著的基因。无论是坏疽性乳腺炎组织还是被金黄色葡萄球菌感染的山羊乳腺上皮细胞，都表现出铁死亡的特征，如铁、MDA和ROS的积累，GSH的减少，以及HMOX1的上调，同时GPX4和SLC7A11的下调；而Fer-1则能逆转这些过程。与自噬相关的蛋白质BNIP3、FUNDC1和LC3表达上调，Mdivi-1则能抑制这些蛋白质并减轻铁死亡。抑制HMOX1能够降低铁死亡和炎症反应。本研究证实HMOX1通过促进自噬来驱动铁死亡，为该疾病的发病机制提供了新的见解，并为潜在的治疗策略提供了依据。

引言

乳腺炎是全球山羊产业中最普遍且最严重的疾病之一。它不仅会降低泌乳性能并降低牛奶质量，在严重情况下还可能导致奶山羊死亡，造成重大经济损失。近年来，随着奶山羊养殖业的扩大，乳腺炎的发病率显著增加，尤其是由金黄色葡萄球菌感染引起的坏疽性乳腺炎。受感染的动物通常会出现发热、抑郁或卧地不起、乳腺明显肿胀和发绀，以及浆液性或带血的乳腺分泌物；严重病例可能导致乳腺功能丧失或死亡。坏疽性乳腺炎的进展与早期细菌控制失败、细菌载量高、吞噬作用减弱以及乳汁中α-毒素和LukMF′浓度升高有关（Rainard等，2018；Anil等，2024）。坏疽性乳腺炎常伴随丙二醛（MDA）和急性期蛋白（IL-1β、IL-6、TNF-α）的升高，以及谷胱甘肽（GSH）水平和抗氧化酶活性的降低，表明存在明显的炎症和氧化应激反应（El-Deeb，2013）。然而，以往的研究主要集中在临床结果、病原体毒力或炎症和氧化 biomarkers 上；关于奶山羊坏疽性乳腺炎发病机制的研究仍相对缺乏，这阻碍了有效预防措施的发展。我们旨在探究坏疽性乳腺炎的分子机制，为开发新的有效预防策略奠定基础。

铁死亡（ferroptosis）是一种依赖铁的程序性细胞死亡形式，其形态学、生化和遗传特征不同于经典的细胞死亡机制（如凋亡、自噬和坏死）（Stockwell等，2017）。近年来，铁死亡在乳腺炎进展中的作用引起了广泛关注。其发生涉及炎症信号通路的异常激活和氧化应激的加剧。在乳腺炎中，铁死亡与乳腺上皮细胞的损伤密切相关，其调控网络可能包括经典的炎症通路，如TLR4/NF-κB。在致病过程中，异常的铁积累会催化脂质过氧化反应，产生有害物质，导致膜结构破坏、细胞器功能障碍，最终破坏乳腺组织（Zhang等，2022）。铁代谢是铁死亡的关键驱动因素，其稳态依赖于铁吸收、储存和释放的精确调控。当铁过载时，Fe2?通过Fenton反应生成羟基自由基（hydroxyl radicals），引发脂质活性氧（ROS）的爆发，从而诱导铁死亡（Gao等，2016）。血红素加氧酶1（HMOX1）可将血红素降解为胆绿素（biliverdin）、一氧化碳（CO）和Fe2?，后者直接促进铁死亡（Liao等，2023）。进一步研究表明，Nrf2的激活通过上调HMOX1增加细胞内的自由铁释放，抑制GPX4活性，并协同促进铁死亡，进而加剧细胞炎症（Wei等，2024）。先前的研究表明，siRNA介导的HMOX1敲低可以通过减少细胞内Fe2?积累和脂质ROS的产生来缓解铁死亡（Tang等，2021）。

自噬（mitophagy）是一种选择性自噬过程，通过清除受损的线粒体来维持线粒体稳态（Wang等，2023）。这一过程可通过PINK1-Parkin泛素依赖途径和非泛素依赖途径触发。在病理条件下，功能异常的线粒体会产生大量ROS并释放促凋亡因子，加剧细胞损伤并严重破坏细胞稳态和功能。因此，及时清除这些线粒体至关重要（Picca等，2023）。虽然铁死亡可能引起细胞损伤，但自噬可通过防止功能异常的线粒体释放ROS来提供保护。在轻微应激或铁过载的早期阶段，清除细胞内铁离子可以减少ROS的产生并抑制铁死亡；然而，自噬的过度激活可能会释放额外的铁离子，从而促进脂质过氧化并加重铁死亡（Chu等，2023）。研究表明，FUNDC1受体介导的自噬可通过线粒体蛋白质导入系统将GPX4摄入线粒体，在那里被降解，最终导致肝细胞中的铁死亡（Bi等，2024）。相反，在HT22细胞中抑制自噬可以降低亚铁离子和脂质过氧化物的水平，从而抑制铁死亡（Li等，2024）。因此，铁死亡与自噬的程度密切相关，尽管其具体的分子机制仍需进一步探讨。

在本研究中，我们从一只患有坏疽性乳腺炎的奶山羊身上分离出金黄色葡萄球菌，并在体内和体外研究中使用该菌株，结合高通量测序技术，以识别关键的致病基因。研究目的是探究坏疽性乳腺炎的分子机制，特别是铁死亡在乳腺炎进展中的作用及其与炎症反应的相互作用。研究结果将为确定潜在的治疗靶点提供理论基础。

章节摘录

研究设计与实验概述

本研究包含四个连续的部分（图S1）。首先，从患有自然发生坏疽性乳腺炎的奶山羊中获取乳样，用于细菌分离、纯化、革兰氏染色、测序和种属鉴定。然后，使用确认的金黄色葡萄球菌分离株建立体内模型。山羊被随机分为三组：对照组（CON）、临床乳腺炎组（CLM）和坏疽性乳腺炎组（GSM）（每组n=3只），分组依据是接种PBS与否或接种不同剂量的金黄色葡萄球菌。

接种金黄色葡萄球菌后的临床、细菌学和病理学发现

从当地群体中患有自然发生坏疽性乳腺炎的奶山羊身上采集乳样，并对分离株进行纯化。该分离株表现出β-溶血现象，革兰氏阳性球菌形态，并且16S rRNA序列与金黄色葡萄球菌NCTC 9555完全相同，确认了其种属（图S2A）。接种后72小时，对照组的乳腺未见变化，临床乳腺炎组的乳腺出现红斑和硬化，坏疽性乳腺炎组的乳腺呈现发绀、肿胀和硬度增加（图S2C）。乳汁颜色为白色且均匀。

讨论

在本研究中，较高浓度的金黄色葡萄球菌引发了典型的坏疽性乳腺炎，而较低浓度仅导致了临床乳腺炎。与以往的研究相比，这种差异可能反映了细菌菌株的毒力和个体山羊的免疫状态（Rainard等，2018）。先天防御机制和可能存在的适应性免疫可能控制了低剂量感染，而高剂量则超过了这些防御机制（Kerro Dego和Vidlund，2024）。

结论

在奶山羊的坏疽性乳腺炎中，铁死亡被激活，这种细胞死亡机制与乳腺组织的坏死病理过程密切相关。抑制剂研究和HMOX1敲低实验进一步证实，金黄色葡萄球菌感染会触发山羊乳腺上皮细胞中的HMOX1依赖性自噬介导的铁死亡。这些发现为金黄色葡萄球菌引起的奶山羊坏疽性乳腺炎的发病机制提供了机制上的见解。

伦理声明

本研究遵循以下动物福利和/或报告指南进行：中华人民共和国国家标准GB/T 35892-2018《实验动物——动物福利伦理审查指南》。本研究获得了西北农林科技大学动物伦理与福利委员会的批准（批准编号：XN2023-1111）。

资助声明

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：31772788和32473078）的支持。

CRediT作者贡献声明

李慧聪：数据验证。傅明哲：数据可视化、方法学研究、数据分析、数据整理。高家俊：数据验证。安晓鹏：文本撰写——审稿与编辑、监督。庄胜：文本撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学研究、数据分析。范云鹏：监督、项目管理、资金筹措、概念设计。刘尼尚：数据验证。王兴晨：

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本论文期间，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来改进语言表达、语法和可读性。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢西北农林科技大学传统中医兽医研究所的所有工作人员在实验中的协助。

作者：谭学文|傅明哲|李慧聪|高家俊|王兴晨|刘尼尚|刘英秋|张卫民|庄申|安晓鹏|范云鹏|西北农林科技大学兽医学院，中国杨陵712100