评估用于检测环境中禽流感病毒的采样策略

《Virology》：Evaluating sampling strategies for the detection of avian influenza viruses in the environment

　　

摘要

高致病性禽流感（HPAI）病毒对野生动物、家畜和人类健康构成了日益严重的威胁，这凸显了建立可扩展且具有早期预警功能的监测系统的必要性。环境RNA（eRNA）监测通过检测释放到环境中的病毒遗传物质，提供了一种非侵入性且成本效益高的替代传统基于宿主采样方法的方式。尽管这种方法非常有用，但不同环境采样方法在检测禽流感病毒（AIV）方面的相对效能仍不明确。本研究在新西兰的两个城市水禽池塘进行了为期约一年的纵向研究，评估了四种eRNA采样策略——新鲜粪便、沉积物、主动过滤水和被动过滤水——检测AIV的能力。通过结合宏基因组测序和RT-qPCR技术，我们发现所有样本类型都能检测到AIV，但检测结果在不同采样方法、地点和时间点之间存在很大差异。虽然宏基因组测序提供了包括亚型鉴定和系统发育背景在内的宝贵基因组数据，但RT-qPCR显示出更高的敏感性，其中主动过滤水的检测率最高，目前是大规模监测中更具成本效益的方法。值得注意的是，不同样本类型之间的AIV检测结果存在异步性，并且经常缺乏时间一致性，这表明环境异质性、RNA的持久性以及方法学的检测限制对监测结果有显著影响。尽管存在这些不一致性，系统发育分析表明检测到的病毒属于已知的澳新大陆谱系，这突显了环境监测在捕捉生态相关病毒多样性方面的能力。我们的研究结果表明，基于eRNA的监测作为AIV监测的补充工具具有巨大潜力，但其有效性高度依赖于所使用的环境采样策略和实验室检测方法。

引言

禽流感病毒（AIV，物种：Alphainfluenzavirus influenzae）在自然生态系统中经常被检测到，尤其是在野生水禽群体中，其中低致病性禽流感（LPAI）病毒株通常在宿主体内传播而不会引起明显的疾病症状（1）。相比之下，高致病性禽流感（HPAI）病毒（尤其是H5N1亚型）的出现和全球传播对动物和公共健康构成了重大威胁。事实上，H5N1从受感染的动物（如家禽和其他家畜）传播给人类的频率不断增加，以及其在牛群中的地方性感染（2），加剧了人们对它可能引发全球大流行的担忧。迄今为止，HPAI H5N1已传播到每个大陆。尽管在新西兰尚未发现该病毒，但通过主动监测，在水禽和其他水鸟中已多次检测到LPAI病毒（3）。

高效的大规模病毒监测对于追踪病毒的出现和入侵至关重要。传统的监测方法通常涉及直接从野生动物或家养动物中采样。虽然这种方法可以提供关于病毒宿主范围的宝贵信息，但它往往耗时、成本高昂，需要专业技能，并且可能使野外工作人员面临感染风险（4）。相比之下，使用环境DNA（eDNA）或RNA（eRNA）进行病毒监测依赖于检测在活动感染期间释放到环境中的病毒遗传物质。直接从环境中采样病毒核酸可能提供了一种更简单、更安全、侵入性更低且更具成本效益的替代方法，可以在大规模范围内实施（5）——这是监测AIV的一个有前景的策略（6）。环境采样在检测AIV方面已经取得了成功（7, 8）；然而，需要长期评估环境采样策略，以了解AIV随时间的变化以及哪些方法适合特定环境中的AIV检测。

在这项研究中，我们评估了四种eRNA采样策略在大约一年的时间内在城市池塘环境中的AIV检测能力，并使用宏基因组学和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）比较了它们的检测灵敏度。这项工作加深了我们对eRNA方法检测AIV能力的理解，也揭示了AIV在环境中的变化情况，这对于提高快速检测AIV和预测AIV传播风险至关重要。

章节片段

方法

样本每月采集一次，持续约一年，来自两个已知栖息着大量水禽（主要是绿头鸭Anas platyrhynchos）的大型城市池塘。具体来说，从2024年6月到2025年3月，每月从位于新西兰达尼丁植物园（DBG）、达尼丁和安德森公园（AP）以及因弗卡吉尔（相距约290公里）的池塘中采集四种类型的样本。这些地点全年都有水禽栖息。这四种样本类型...

结果

我们收集了粪便（n = 213份）、沉积物（n = 136份）、主动过滤水（n = 132份）和被动过滤水（n = 157份）样本。除6月外，所有样本类型和月份都检测到了AIV转录本（图1和表1）；然而，样本类型与采样月份之间的重叠程度很小。通过批量RNA测序，每个文库平均产生了9450万个配对末端读段（范围：6890万至1.541亿个）。使用宏基因组学方法在春季检测到的AIV非常有限...

讨论

我们在两个城市水禽池塘中对四种环境采样策略进行了为期约一年的评估，以评估它们检测AIV的相对效能。这使我们能够了解AIV检测的时间变化，并确定采样方法和分析方法（宏基因组测序与RT-qPCR）如何影响检测灵敏度。所有采样方法（粪便、沉积物、主动过滤水和被动过滤水）都成功检测到了AIV...

作者贡献声明

Jemma Geoghegan：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、监督、资源管理、项目协调、资金争取、概念构思。Edwina J Dowle：撰写——审稿与编辑、监督。Lia Heremia：撰写——审稿与编辑、方法论研究、数据分析。Allison K Miller：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、项目协调、方法论研究、数据分析。Neil J Gemmell：撰写——

未引用参考文献

23..

伦理声明

本研究未涉及任何动物的处理。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

病毒序列数据可通过NCBI的GenBank数据库获取，访问号为PX376089-PX376093。

资金支持

本研究得到了新西兰Te Niwha传染病研究平台的资助（项目编号：TN/SWC/24/UoOJG），该平台由公共卫生研究所、法医学研究所和奥塔哥大学共同主办。WHO合作参考与研究中心得到了澳大利亚卫生部的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

我们要感谢达尼丁植物园、安德森公园和因弗卡吉尔市政府团队，特别是Dylan Norfield和Derek Winwood允许我们在其场地进行采样，以及Eric Odell带领我们参观达尼丁植物园。AKM还要感谢Gemmell实验室的成员（尤其是Sara Ferreira和Joanne Gillum）的帮助，以及JCC和PL在采样方面的协助。AKM还要感谢东奥塔戈Taiāpure管理委员会的帮助...

“Allison K. Miller | Lia Heremia | Stephanie J. Waller | Sarah-Lou Blanchard | Jordan T. Taylor | Jackson M. Treece | Michelle Wille | Neil J. Gemmell | David Winter | Edwina J. Dowle | Jemma L. Geoghegan”

奥塔哥大学解剖学系，新西兰达尼丁