《Virology》：In-depth comparison of dengue virus laboratory strains and clinical isolates in terms of growth properties and NS1 production and detection in hepatic and non-hepatic cell lines
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摘要登革热病毒（DV）是一种主要的虫媒病毒病原体，肝脏是其主要靶器官。该病毒的非结构蛋白1（NS1）在复制、自身免疫和致病机制中起重要作用，但不同菌株在NS1分泌和细胞反应方面的差异尚未完全明了。本研究中，观察了实验室菌株和低传代临床分离株感染 hepatocytes 后的病毒复
摘要
登革热病毒（DV）是一种主要的虫媒病毒病原体，肝脏是其主要靶器官。该病毒的非结构蛋白1（NS1）在复制、自身免疫和致病机制中起重要作用，但不同菌株在NS1分泌和细胞反应方面的差异尚未完全明了。本研究中，观察了实验室菌株和低传代临床分离株感染 hepatocytes 后的病毒复制动力学、NS1的产生/检测以及细胞凋亡情况。所有菌株均能有效复制，尽管实验室菌株的复制效率略高于临床分离株。NS1的分泌模式在不同菌株间存在差异：感染期间主要在细胞内积聚，而转染了NS1质粒的细胞则表现为细胞外NS1分泌增多。共感染实验显示病毒之间没有干扰作用，各血清型均保持了各自的复制特征。在非肝细胞系（如Min6和Vero细胞）中，病毒复制和NS1分泌均受到抑制，表明这些过程依赖于细胞类型。值得注意的是，尽管DV1实验室菌株的病毒复制活跃，但其NS1通过NS1抗原ELISA检测不到。定点突变分析发现，位置237处的亮氨酸对于NS1的检测至关重要，单个氨基酸替换（Leu237→Gln）会降低NS1的检测能力。DV感染和NS1表达均能诱导caspase-3的活化，但不会导致DNA断裂，从而使病毒能够更长时间地利用宿主细胞机制进行复制。这些发现突显了NS1生物学特性在不同菌株间的差异，对登革热的发病机制和诊断具有重要意义。
引言
登革热是一种威胁生命的虫媒病毒性疾病，每年约有3.9亿人感染，其中9600万人出现临床症状。因此，大量感染者没有症状。登革热在100多个国家流行，影响了全球近一半的人口，主要发生在热带和亚热带地区（Bhatt等，2013年）。
登革热病毒（DV）属于黄病毒科（Flaviviridae），由雌性伊蚊传播给人类。感染任何一种血清型（DV1-4）都可能无症状，或表现为从“无预警症状的登革热”到“有预警症状的登革热”乃至“重症登革热”（WHO和TDR，2009年）。病毒颗粒直径约为500埃，含有正链RNA基因组（约10.7千碱基对），编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白（Kuhn等，2002年）。
登革热影响多个器官系统，尤其是肝脏（Fernando等，2016年）。肝脏功能障碍是登革热的重要特征（Samanta和Sharma，2015年）。NS1蛋白（48千道尔顿）以六聚体形式从感染哺乳动物细胞中分泌出来，是常用的诊断标志物（Paranavitane等，2014年）。NS1对病毒复制至关重要（Fan等，2014年），其分泌形式还参与补体激活（Avirutnan等，2010年）和致病过程。NS1还具有病原相关分子模式（PAMP）的作用，可激活TLR4并诱导促炎细胞因子和趋化因子（Modhiran等，2015年）。血液中循环的可溶性NS1（sNS1）水平在无预警症状和有预警症状的登革热患者中分别为0.04-0.6微克/毫升，在重症登革热患者中为0.6-2.5微克/毫升，部分病例甚至高达15微克/毫升。sNS1可在发热后持续存在于血液循环中4-6天（Libraty等，2002年）。在小鼠模型中，sNS1主要在肝脏中积聚，肝细胞是其主要靶细胞（Alcon-Lepoder等，2005年）。
尽管对登革热病毒生物学有大量研究，但不同菌株在复制、NS1分泌、检测能力及其相关细胞反应方面的差异仍不完全清楚，特别是在实验室菌株和低传代临床分离株之间。共感染对哺乳动物细胞的影响以及病毒复制和NS1动态的细胞类型依赖性变化也尚未充分了解。本研究通过比较多种DV血清型在肝细胞和非肝细胞中的病毒复制和NS1产生情况来解决这些空白。此外，还探讨了NS1序列变异对抗原检测能力的影响，并评估了DV感染和/或NS1表达期间的细胞应激和凋亡信号通路。
章节片段
细胞培养
Huh7、Min6和Vero细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和Pen-Strep及L-谷氨酰胺混合物的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。实验过程中使用添加了2% FBS的DMEM（DMEM-2）维持单层细胞培养。
登革热病毒
血清样本来自2017年加尔各答登革热爆发期间确诊的感染者，采样前已获得其书面同意。从存档的血清样本中分离病毒进行培养。
感染后，细胞外的DV RNA拷贝数始终高于细胞内的水平
为了评估不同实验室菌株和临床分离株在病毒复制和子代释放方面的差异，我们监测了IC和EC DV RNA的水平。Huh7细胞分别被三种临床分离株（DV1-3）和三种实验室菌株（DV1_LS、DV2_LS和DV4_LS）感染。所有病毒的接种剂量均为10（MOI），但DV4_LS由于是细胞病变型且不易在培养中达到高病毒载量，因此采用较低的接种剂量。
讨论
本研究使用了实验室菌株和低传代临床分离株分析肝脏细胞中的DV感染情况。选择临床分离株（第5代）是为了更好地反映循环病毒的多样性及临床实际（Diamond等，2000年）。与先前的报告一致，这些临床分离株在早期传代时具有非细胞病变性和不形成病毒斑块的特性（Raut等，2019年）。在实验室菌株中，DV1_LS和DV2_LS是非细胞病变型，而DV4_LS则形成病毒斑块。
CRediT作者贡献声明
Himadri Nath：负责撰写、审稿和编辑、数据可视化、验证、软件选择、方法设计、实验实施及数据分析。Abhishek De：负责撰写、审稿和编辑、数据可视化、资源管理、项目管理、方法设计、实验实施及数据分析。Keya Basu：负责撰写、审稿和编辑、数据可视化、验证、项目管理、方法设计、实验实施及数据分析。Chiroshri Dutta：负责撰写、审稿和编辑。
伦理审批
本研究遵循所有相关机构的伦理标准（符合1964年赫尔辛基宣言及其后续修订版）。研究获得了CSIR-IICB和加尔各答国家医学院（CNMC）伦理委员会的批准。所有实验均按照相关指南和规定进行。相关伦理审批编号如下：
作者声明不存在任何可能影响本研究结果的竞争性利益关系。
资金支持
本研究得到了CSIR-IICB对Subhajit Biswas的支持（项目编号：OLP-118）。
作者声明没有已知的可能影响本文研究结果的竞争性财务利益或个人关系。
作者感谢CSIR-IICB主任提供的基础设施支持和资金（项目编号：IICB/PME/2026-27/014）。S.B.还感谢AcSIR的支持。C.D.和H.N.感谢CSIR提供的研究奖学金。作者还感谢CSIR-IICB提供的各种设施，包括中央仪器设施（CIF）。资助方未参与研究设计、数据收集和分析过程。
Chiroshri Dutta|Himadri Nath|Keya Basu|Abhishek De|Subhajit Biswas
印度化学生物学研究所（IICB）传染病与免疫学部门，加尔各答-700032，西孟加拉邦
