dmrt基因家族的进化保守性及比目鱼伪雄鱼睾丸分化过程中性别偏向的dmrt2a表达

《Water Biology and Security》：Evolutionary conservation of the dmrt gene family and sex-biased dmrt2a expression during pseudo-male testis differentiation in flatfish

　　

对半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）进行了^dmrt基因家族的全基因组鉴定。共鉴定出六个^dmrt基因（^dmrt1、^dmrt2a、^dmrt2b、^dmrt3、^dmrt4、^dmrt5），所有基因均包含保守的DM（doublesex and mab-3）DNA结合结构域。系统发育与共线性分析揭示了硬骨鱼类中保守的^dmrt1/2/3基因组簇。^Dmrt2a表现出显著的性别偏向表达，并在伪雄鱼中显著上调。多组学证据表明，^dmrt2a通过调控TGF-β（transforming growth factor beta）、MAPK（mitogen-activated protein kinase）和Wnt信号通路促进睾丸分化及性别逆转。

**《半滑舌鳎dmrt基因家族的进化保守性及dmrt2a在伪雄鱼睾丸分化中的性别偏向表达》论文解读**

**研究背景与目的**
鱼类是最古老且多样性最高的脊椎动物类群，其性别决定机制复杂多样。dmrt（doublesex and mab-3 related transcription factor）基因家族因含有高度保守的DM（doublesex and mab-3）DNA结合结构域，在性别决定、性腺分化和胚胎发育中发挥关键作用。半滑舌鳎（*Cynoglossus semilaevis*）具有ZW/ZZ雌性异配性别决定系统，且频繁发生温度诱导的雌性向雄性性逆转，是研究遗传与环境互作调控性别分化的理想模型。然而，该物种中dmrt基因家族的系统鉴定及其在性别分化中的潜在功能尚未被系统研究。本研究旨在通过全基因组鉴定、进化分析、表达谱和功能实验，揭示dmrt基因家族在半滑舌鳎中的进化保守性，并重点探究dmrt2a在伪雄鱼睾丸分化及性逆转中的作用机制。

**主要技术方法**
研究人员从NCBI数据库获取多个代表性脊椎动物的Dmrt蛋白序列，利用BLAST和HMMER对半滑舌鳎基因组进行搜索，鉴定含完整DM结构域的dmrt基因；通过MEGA 11的邻接法构建系统发育树，并结合MEME分析保守基序；利用TBtools进行染色体定位与共线性分析。表达分析基于多组织转录组数据（未发表）和单细胞表达数据。功能实验包括构建dmrt2a-FLAG真核表达载体转染HEK293T细胞，通过pull-down和LC–MS/MS（液相色谱-串联质谱）鉴定互作蛋白；在半滑舌鳎精巢细胞中过表达dmrt2a，进行转录组测序（RNA-Seq）分析差异表达基因。所有样本均来源于半滑舌鳎及标准细胞系。

**研究结果**
**3.1 半滑舌鳎dmrt基因的鉴定与染色体分布**
通过基因组筛选，在半滑舌鳎中鉴定出6个dmrt基因，即dmrt1、dmrt2a、dmrt2b、dmrt3、dmrt4和dmrt5。所有基因均编码含有保守DM结构域的核蛋白，分子量34.83～232.38 kDa，等电点4.44～6.41。染色体定位显示，dmrt1、dmrt2a和dmrt3紧密聚集在同一染色体上形成保守的dmrt1/2/3基因簇；dmrt2b和dmrt5共定位于另一染色体，dmrt4则位于独立染色体，暗示谱系特异性重排。

**3.2 dmrt基因家族的系统发育与结构分析**
系统发育树解析出六个支持良好的分支，分别对应dmrt1、dmrt2a、dmrt2b、dmrt3、dmrt4和dmrt5。Dmrt1与各脊椎动物直系同源物聚为古老且高度保守的支系；Dmrt2a和Dmrt2b作为姊妹群，支持硬骨鱼特异的复制事件。基因结构显示，所有成员均含有一个N端DM结构域，但外显子-内含子组织差异显著：dmrt1有5个外显子，dmrt2a和dmrt2b各有3个，dmrt3、dmrt4和dmrt5则含2或3个外显子。该结构差异提示潜在的功能分化。

**3.3 半滑舌鳎Dmrt蛋白的保守基序组成**
MEME基序分析鉴定出10个保守基序。其中基序1对应DM结构域，存在于所有旁系同源物中，表明DNA结合区域的高度保守。Dmrt1、Dmrt2a和Dmrt2b共享多个N端基序，而Dmrt3、Dmrt4和Dmrt5具有独特的C端基序，进一步支持功能特化。

**3.4 dmrt基因家族的染色体定位与保守共线性**
比较共线性分析显示，dmrt1/2/3基因组簇在半滑舌鳎、斑马鱼、红鳍东方鲀及人类中均保守存在，侧翼基因kank1、fbxl3和tmem88也跨物种保留，表明该基因簇受强烈进化约束。dmrt4和dmrt5在不同物种中位置多变，反映外围成员的更大可塑性。

**3.5 dmrt基因的表达模式及dmrt2a和dmrt2b的细胞类型分布**
转录组热图显示，dmrt1和dmrt2a在雄鱼和伪雄鱼睾丸中高表达，且dmrt2a上调最为显著；dmrt3和dmrt4在脑中高表达，dmrt5表达均匀。单细胞数据表明，dmrt2a主要定位于生殖细胞和支持性体细胞，而dmrt2b主要表达于巨噬细胞和生殖细胞。

**3.6 dmrt2a的Western blotting和pull-down结果**
成功构建p3×FLAG-CMV14-dmrt2a真核表达载体并转染HEK293T细胞，Western blot在约66 kDa处检测到特异性条带，pull-down实验证实重组Dmrt2a被有效富集，为后续蛋白质鉴定提供基础。

**3.7 通过LC-MS/MS鉴定dmrt2a蛋白**
LC-MS/MS分析确认了Dmrt2a衍生肽段，并鉴定出大量互作蛋白。KEGG和GO富集分析显示，这些蛋白显著富集于信号转导、染色体组织和Wnt信号通路。PPI网络分析鉴定出染色体相关簇（含SMC2、SMC4、RAD21、TOP2A等）和Wnt信号簇（含CTNNB1、GSK3B、APC、AXIN1等），提示Dmrt2a可能参与染色质重塑和Wnt/β-catenin信号调控。

**3.8 dmrt2a过表达及差异表达**
在半滑舌鳎精巢细胞中过表达dmrt2a后，RNA-Seq共鉴定出3009个差异表达基因（DEGs），其中2768个上调，241个下调。上调基因包括igf2、igfbp1a、smad7、map2k2、acvr1、bmp4、bmp6等，涉及TGF-β、MAPK及生长因子信号；下调基因主要富集于核糖体生物发生、代谢和免疫过程。

**3.9 dmrt2a过表达后DEGs的功能富集分析**
KEGG富集分析显示，上调DEGs显著富集于MAPK信号通路、TGF-β信号通路和肌动蛋白细胞骨架调控；下调DEGs富集于核糖体、PPAR信号和细胞因子-细胞因子受体互作。这表明dmrt2a过表达激活了促性腺分化相关信号，同时抑制一般生物合成和免疫相关通路。

**讨论与结论**
讨论部分指出，半滑舌鳎dmrt基因库与大多数硬骨鱼一致，保留了dmrt2a和dmrt2b，表明复制后的亚功能化。dmrt1/2/3基因簇的保守性体现了其在生殖进化中的祖先作用。dmrt2a在伪雄鱼中的显著上调及其在染色质调控和Wnt信号中的富集，提示环境信号可能通过表观修饰影响Wnt响应和类固醇合成平衡，进而促进dmrt2a表达，推动性逆转。体外过表达实验进一步表明，dmrt2a可激活TGF-β和MAPK通路，抑制核糖体及免疫相关通路，支持其作为睾丸分化上游整合因子的假说。

**结论**
综上所述，整合基因组和结构分析在半滑舌鳎中鉴定出六个保守的dmrt基因（dmrt1、dmrt2a、dmrt2b、dmrt3、dmrt4、dmrt5），与多数硬骨鱼基因组成一致。所有基因均含有N端特征性DM结构域，但外显子位置存在差异，反映该功能基序受到强进化约束。外显子-内含子组织及附加基序的差异提示旁系同源物间的功能分化。系统发育分析支持dmrt2a和dmrt2b起源于硬骨鱼特异复制并发生部分功能分化。染色体定位和共线性分析表明dmrt1/2/3簇在脊椎动物中高度保守。蛋白质组和转录组证据揭示，dmrt2a与染色质重塑、TGF-β/MAPK/Wnt信号、代谢途径、类固醇生成途径、核糖体过程及TLR相关免疫途径相关。这些协调的转录变化表明，dmrt2a在伪雄鱼睾丸分化的性腺命运决定中可能作为上游整合因子，并可能促进硬骨鱼的性别逆转。