靶向溴结构域和末端外蛋白重编程巨噬细胞并抑制乳腺癌进展

《Frontiers in Immunology》：Targeting bromodomain and extra-terminal proteins reprograms macrophages and inhibits breast cancer progression

　　

摘要
引言：乳腺癌（BC）仍然是癌症相关死亡的主要原因，治疗耐药驱动肿瘤进展。虽然免疫检查点抑制剂（ICI）疗法在某些乳腺癌中有效，但治疗反应的异质性部分由癌症干细胞（CSCs）和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）驱动。溴结构域和末端外蛋白（BET）调节肿瘤和免疫生物学，但其在先天抗肿瘤免疫中的作用仍知之甚少。研究人员使用强效BET降解剂（BETd）ZBC260研究了BET蛋白在调节先天免疫中的作用。
方法：在携带D2A1肿瘤的免疫功能正常BALB/c小鼠中评估ZBC260的疗效。消耗NK细胞或巨噬细胞以确定它们对BETd反应的贡献。在体外，使用原代小鼠NK细胞、骨髓来源巨噬细胞以及THP-1、NK-92 MI、SUM-149和D2A1细胞进行共培养、Transwell迁移、吞噬、qPCR、ELISA和流式细胞术实验。使用10x Genomics 3′测序进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并使用Seurat分析。
结果与讨论：ZBC260在SCID小鼠中抑制肿瘤生长，但在NOD-SCID小鼠中未抑制，后者巨噬细胞受损且NK细胞部分受损，表明先天免疫系统参与。为了评估先天免疫细胞对BETd疗效的贡献，研究人员在携带D2A1肿瘤的免疫功能正常BALB/c小鼠中消耗NK细胞或巨噬细胞，并给予ZBC260或载体。免疫消耗研究显示，巨噬细胞损失部分减弱了抗肿瘤和抗CSC效应，突出了它们的关键作用。为了解BETd对TME群体（即肿瘤微环境中的细胞组成）的影响，研究人员进行了单细胞RNA测序，确定髓样细胞为主要群体。BETd减少了MRC1⁺免疫调节肿瘤相关巨噬细胞，并富集了CD74⁺抗原呈递巨噬细胞，上调了吞噬体通路并增强了Stat1激活。在体外，BETd下调M2相关标志物，促进巨噬细胞吞噬，诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制巨噬细胞驱动的CSC形成。总之，这些发现表明BETd ZBC260重塑TME并将巨噬细胞重编程为抗肿瘤表型，突出了其在乳腺癌治疗中的转化潜力。
结论：总之，这些发现表明BETd ZBC260重塑TME并将巨噬细胞重编程为抗肿瘤表型，突出了其在乳腺癌治疗中的转化潜力。

论文解读

乳腺癌（BC）是女性癌症死亡的主要原因，治疗耐药和肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制状态是导致疗效不佳的关键因素。癌症干细胞（CSCs）具有自我更新和耐药特性，尤其在侵袭性亚型如三阴性乳腺癌（TNBC）中，它们与免疫检查点抑制剂（ICI）治疗反应异质性密切相关。溴结构域和末端外蛋白（BET）是表观遗传调控因子，能够调节肿瘤和免疫细胞功能，但其在先天抗肿瘤免疫中的具体作用仍不明确。研究人员基于前期工作，利用强效BET降解剂（BETd）ZBC260，探讨BET蛋白降解对TME中巨噬细胞和NK细胞等先天免疫细胞的影响及机制，以期阐明BET靶向治疗的免疫学基础。

该研究在免疫功能正常BALB/c小鼠的D2A1乳腺肿瘤模型中评估ZBC260的疗效，并通过抗体或氯膦酸盐脂质体分别消耗NK细胞或巨噬细胞，发现巨噬细胞是ZBC260发挥抗肿瘤和抗干性作用的关键介质。随后，研究人员对治疗前后的肿瘤组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析TME中细胞组成和转录变化，并结合体外共培养实验验证巨噬细胞极化、迁移、吞噬功能及其对CSC群体的调节。研究结果表明，ZBC260通过重塑TME和重编程巨噬细胞向抗肿瘤表型，抑制乳腺癌进展。相关成果发表于《Frontiers in Immunology》。

主要技术方法包括：使用免疫缺陷SCID和NOD-SCID小鼠模型以及免疫功能正常BALB/c小鼠模型进行体内肿瘤生长实验；通过抗体介导NK细胞或巨噬细胞消耗；采用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序并利用Seurat分析；体外使用原代小鼠骨髓来源巨噬细胞、人THP-1巨噬细胞、NK-92MI细胞、SUM149和D2A1细胞进行共培养、迁移、吞噬、凋亡、qPCR、ELISA、蛋白质印迹和流式细胞术分析；采用极限稀释再移植实验评估肿瘤起始细胞（TIC）频率。细胞系来源包括Karmanos癌症研究所、美国国家癌症研究所等机构，动物实验经密歇根大学动物护理和使用委员会批准。

**巨噬细胞而非NK细胞介导ZBC260的抗肿瘤和抗CSC活性**
在CB17-SCID小鼠中，ZBC260有效抑制SUM149肿瘤生长，但在NOD-SCID小鼠中无效，提示完整的先天免疫细胞是药物疗效所必需。在BALB/c小鼠中，NK细胞消耗不影响ZBC260对D2A1肿瘤的生长抑制，体外实验也显示ZBC260不改变NK细胞活力、细胞毒性或迁移能力。相比之下，巨噬细胞消耗显著减弱ZBC260的抗肿瘤效果，并通过极限稀释分析（ELDA）证实，巨噬细胞消耗部分逆转了ZBC260降低肿瘤起始细胞（TIC）频率的作用，从而明确巨噬细胞是BETd疗效的关键介导者。

**BETd ZBC260重塑髓系细胞以增强抗肿瘤活性**
scRNA-seq分析显示，髓系细胞是D2A1肿瘤TME中的主要免疫群体。ZBC260处理后，免疫抑制性Mrc1⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAM）比例减少，而CD74⁺抗原呈递TAM比例增加。基于M1型和M2型基因特征的评分显示，ZBC260升高M1样评分并降低M2样评分。转录因子富集分析预测Stat1是介导该表型转换的关键调控因子。

**BETd ZBC260促进髓系介导的免疫激活并破坏免疫抑制信号**
差异基因表达分析显示，ZBC260处理上调了1,205个基因中的736个，其中包含与先天免疫应答、白细胞迁移、淋巴细胞激活和抗原加工呈递相关的通路。KEGG通路分析提示吞噬体形成增强。细胞间通讯分析（CellChat）表明，ZBC260增加了髓系细胞与淋巴细胞之间通过APP-CD74的相互作用，同时减少了FN1、SPP1介导的促肿瘤信号，并完全破坏了LGALS9介导的免疫抑制信号。

**BETd ZBC260选择性促进M1巨噬细胞募集并抑制M2极化**
体外Transwell实验显示，ZBC260预处理增强M1巨噬细胞向肿瘤条件培养基的迁移，但不影响M2迁移；在肿瘤球模型中，ZBC260减少M2巨噬细胞浸润，而不影响M0或M1浸润。在极化标志物检测中，ZBC260上调M1型标志物（如NOS2）和细胞因子（IL-1B、CXCL10），下调M2型标志物（如MRC1、CD163、IL10）和细胞因子（sCD163、IL-10）。机制上，ZBC260降低了M2极化关键转录因子STAT6的总蛋白表达和磷酸化激活。

**BETd ZBC260增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬**
活细胞成像和流式细胞术显示，ZBC260处理后，THP-1巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞对SUM149或D2A1肿瘤细胞的吞噬比例显著增加，且呈时间依赖性。然而，单独检测巨噬细胞吞噬乳胶珠的能力未受ZBC260影响，提示该效应依赖于肿瘤细胞的预处理或肿瘤-巨噬细胞相互作用。此外，ZBC260与巨噬细胞联合可协同促进肿瘤细胞凋亡。

**BETd通过巨噬细胞依赖机制降低CSC频率**
CytoTRACE分析显示，ZBC260处理降低了体内肿瘤细胞的干性评分，并减少高干性细胞比例。在体外CSC标志物检测中，ZBC260单独处理可减少CD44⁺/CD24^-细胞亚群的比例和数量，而巨噬细胞单独共培养则增加该亚群比例。但在二者联合条件下，特别是3D肿瘤球培养中，CD44⁺/CD24^-细胞群受到更显著抑制，表明ZBC260与巨噬细胞协同抑制CSC群体。

讨论部分指出，该研究首次在免疫功能正常小鼠模型中证明巨噬细胞是BET降解剂ZBC260抗肿瘤和抗干性作用的关键介质。研究通过scRNA-seq揭示了ZBC260对TAM亚群的重塑，即减少免疫抑制性Mrc1⁺TAM并增加抗原呈递性CD74⁺TAM，同时发现Stat1上调与STAT6下调参与该过程。功能上，ZBC260增强巨噬细胞吞噬和抗原呈递能力，促进T细胞招募，并抑制CSC维持。这些发现强调了BET蛋白在TME中的重要性，并提示BET靶向降解可通过调动巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫，为乳腺癌免疫治疗提供新策略。研究结论：ZBC260重塑TME并将巨噬细胞重编程为抗肿瘤表型，凸显其用于乳腺癌治疗的转化潜力。