《Frontiers in Microbiology》：Genomic safety, bacteriocinogenic potential, and probiotic-associated traits of Enterococcus lactis LBM-M3D isolated from the swine gastrointestinal tract
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养猪业对全球粮食安全至关重要，然而，抗生素的过度使用正威胁其可持续性，并加速了多重耐药病原体的出现与传播。益生菌和产细菌素菌株是支持动物健康并减少抗生素依赖的有力策略。本研究对分离自猪胃肠道（porcine gastrointestinal t
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养猪业对全球粮食安全至关重要，然而，抗生素的过度使用正威胁其可持续性，并加速了多重耐药病原体的出现与传播。益生菌和产细菌素菌株是支持动物健康并减少抗生素依赖的有力策略。本研究对分离自猪胃肠道（porcine gastrointestinal tract）的乳酸肠球菌（Enterococcus lactis）LBM-M3D菌株进行了体外抗菌活性、模拟胃肠道条件耐受性、基因组安全性特征以及细菌素生成潜力评估。该菌株能够抑制多种革兰氏阳性猪相关病原体，包括猪链球菌（Streptococcus suis）、猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。此外，LBM-M3D在模拟胃肠道应激条件下（包括pH 3.0和0.5%胆盐暴露）仍能保持活力。全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）鉴定出4条类细菌素序列，分别对应肠溶素A（enterolysin A）、mundticin ATO6、肠球菌素SE-K4（enterocin SE-K4）和肠球菌素P（enterocin P）。在质粒相关区域未检测到获得性抗菌药物耐药基因，而耐药和毒力相关决定子仅由染色体编码。尽管由于物种水平安全性数据有限，E. lactis目前未被列入欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）的合格安全推定（Qualified Presumption of Safety, QPS）清单，但研究人员的基因组分析提供了支持LBM-M3D安全性的菌株水平证据。总体而言，这些研究结果表明，LBM-M3D具有益生菌相关特征，是养猪业中进一步益生菌开发的潜在候选菌株，尚需额外的功能验证，并有望应用于可持续畜牧系统。
论文解读：乳酸肠球菌LBM-M3D的基因组安全性、细菌素生成潜力与益生菌相关特性
一、研究背景与意义
养猪业在全球粮食安全与农业经济中占据重要地位，贡献了超过三分之一的全球肉类产量。然而，自20世纪30年代以来广泛使用的抗生素促生长策略，已导致多重耐药菌的出现和传播，对动物健康、食品安全及公共卫生构成重大威胁。在巴西等主要猪肉出口国，猪源病原菌（如猪链球菌、猪葡萄球菌和粪肠球菌）的耐药率显著上升。肠球菌属作为一个兼具食品生物技术和公共卫生双重意义的类群，近年来受到广泛关注。E. lactis在遗传上高度接近于粪肠球菌（E. faecium）Clade B谱系，并展现出较低的医院相关标志物、获得性耐药基因及毒力因子流行率，因而被认为是益生菌开发的潜在候选菌种。然而，该物种的菌株水平安全性与功能表征仍不充分。本研究基于此背景，对分离自猪（Sus scrofa）胃肠道内容物的E. lactis LBM-M3D菌株进行了系统的益生菌潜力与安全性评估。
二、主要技术方法
研究人员采用多维度策略开展研究：样本采集自巴西圣保罗大学"Fernando Costa"校区猪场3头约30月龄临床健康成年猪（Landrace × Large White杂交商业品种）的盲肠内容物。菌株筛选采用琼脂孔扩散法评估抗菌活性。基因组分析综合利用PacBio Revio平台单分子实时（SMRT）测序技术获得完整基因组，经Hifiasm软件进行从头组装，并通过NCBI原核基因组注释流程（PGAP）进行功能注释。在此基础上，研究人员运用平均核苷酸一致性（ANI）分析、ABRICATE流程（调用CARD、ResFinder、PlasmidFinder等数据库）进行耐药与毒力基因筛查，以及BAGEL和antiSMASH软件预测细菌素生物合成基因簇。部分纯化流程整合了切向流过滤、阳离子交换色谱及高效液相色谱（HPLC）技术。
三、研究结果
3.1 菌株分离、筛选与鉴定
从3头健康猪盲肠内容物中共获得30株形态学上不同的乳酸菌。经琼脂孔扩散法初筛后，2株表现出广谱抗菌活性。安全性初筛排除1株β-溶血阳性菌株后，最终选择1株来自微需氧培养条件、具有非溶血表型的菌株，命名为LBM-M3D。MALDI-TOF质谱初步将其鉴定为E. faecium，但通过后续全基因组测序和ANI分析确认其为E. lactis（与参考基因组E. lactis DH9003的ANI>97.8%）。
3.2 益生菌相关特性评估
3.2.1 生化表征与潜在毒力因子
LBM-M3D对过氧化氢酶、凝固酶、明胶酶和溶血素等酶活性均为阴性。在绵羊血琼脂上表现γ-溶血（非溶血）反应，表明其缺乏这些与致病性相关的酶学特征。
3.2.2 抗菌药物敏感性
采用纸片扩散法与肉汤微量稀释法评估了10种抗生素的敏感性。除红霉素外，该菌株对所有受试抗生素均表现出敏感性。红霉素MIC值（32 μg/mL）超过EFSA肠球菌属临界值，结合基因组中检出的染色体定位的efmA基因，判定为红霉素耐药。
3.2.3 不同pH和胆盐条件下的存活能力
在pH 6.0条件下，LBM-M3D活菌数显著升高（相对存活率304.3%），pH 8.0时保持稳定（相对存活率104.3%）。低浓度胆盐（0.1%）促进生长（相对存活率217.4%）。然而，在pH 3.0时活力急剧下降（相对存活率0.002%），pH 2.0时低于检测限。较高胆盐浓度（0.2%-0.5%）下存活率在6.1%-8.7%之间。
3.3 LBM-M3D上清液的表征
3.3.1 肽类性质
蛋白酶处理实验显示，胰蛋白酶完全消除抗菌活性，胃蛋白酶和蛋白酶K分别使抑菌圈减少超过40%，证实抗菌活性源自蛋白类或肽类成分。
3.3.2 上清液对病原菌的动力学抑制
生长动力学监测表明，LBM-M3D无细胞上清液使猪葡萄球菌延迟2小时进入对数期，粪肠球菌延迟4小时，单核细胞增生李斯特菌延迟5小时，而对猪链球菌则在24小时内完全抑制其可检测的生长。
3.4 HPLC与MALDI-TOF分析
经系列纯化，（HPLC）洗脱图谱中仅在30.9-36.5分钟区间收集的组分10（乙腈浓度46.3%-52.6%）表现出抗李斯特菌活性。蛋白酶完全消化该组分的抗菌活性，进一步支持其肽类本质。
3.5 基因组特征与益生菌相关特征
全基因组测序获得2,741,738 bp的环状基因组（GC含量38.1%，含2,632个编码序列），包含一个160 kb质粒。基因组中鉴定出4种类细菌素序列：肠溶素A、mundticin ATO6、肠球菌素SE-K4和肠球菌素P。所有获得性耐药及毒力相关决定子均位于染色体稳定区域，与可移动遗传元件无关联。
四、讨论与结论
LBM-M3D的基因组分析揭示了多个与安全性相关的关键信息：染色体编码的多药外排转运蛋白（如vanZ、efmA等）属于物种核心基因组中的固有（intrinsic）耐药决定子，而非可转移的获得性耐药基因。毒力相关基因sgrA和acm虽被检出，但均为E. lactis物种核心基因组的共有成分，主要发挥共生定殖因子的功能而非致病作用。溶血素基因的存在未伴随溶血表型，可能是由于溶血素操纵子内部分基因缺失或突变所致。该菌株的胃肠道应激耐受能力、广谱革兰氏阳性抑菌特性及多样化的细菌素编码基因簇，支持其作为多功能益生菌候选菌株的潜力。研究局限性在于，库构建中的大小选择步骤可能导致小质粒丢失，且未鉴定出活性纯化组分中抗菌分子的具体结构。未来需通过LC-MS/MS测序鉴定活性分子、开展体内安全性与功效验证试验，并探索半纯化或微囊化抗菌组分作为饲料添加剂的可行性。本研究为E. lactis物种的菌株水平安全性数据作出了重要贡献，为该物种未来纳入QPS评估提供了科学依据，同时为养猪业减少抗生素依赖、缓解抗菌药物耐药提供了可持续的解决方案。
