肠道真菌组及其跨界相互作用与断奶后母猪发情回归的关联：基于宏基因组分析

《Frontiers in Microbiology》：Associations of the gut mycobiome and its cross-kingdom interactions with estrus return in post-weaning sows revealed by metagenomic analysis

　　

断奶后发情回归是养猪业繁殖效率的关键决定因素。虽然肠道微生物组，特别是细菌，已被显著证实与母猪发情回归相关，但肠道真菌组及其与细菌的跨界相互作用在此背景下的作用仍 largely unexplored。本研究采用粪便宏基因组学方法对85头母猪的肠道真菌组进行了表征，并探究了其与断奶后发情回归的关联。共鉴定出22种与发情回归显著相关的真菌物种。正常发情母猪的特征为Arxiozyma slooffiae（原Kazachstania slooffiae）丰度增加，而Malassezia pachydermatis和Alternaria rosae丰度降低。此外，研究人员发现了与发情回归相关的真菌与细菌之间的跨界相互作用，其中Arxiozyma slooffiae与正常发情母猪中富集的Prevotella spp.呈正相关。这些相互作用被预测涉及代谢物的交换，包括Fe²⁺、硫胺素和烟酸盐。真菌生物标志物在区分正常发情与非发情母猪方面表现出良好的判别能力（AUC = 0.906），而与细菌生物标志物的组合进一步提升了性能（AUC = 0.947）。整合多组学分析揭示了肠道真菌与激素及激素相关化合物，以及微生物功能通路之间的广泛关联。值得注意的是，Arxiozyma slooffiae与植物雌激素（包括大豆黄酮和染料木素）及类固醇激素生物合成通路呈正相关，而与睾酮呈负相关。综上所述，这些发现为肠道真菌组及其跨界相互作用在母猪繁殖性能中的作用提供了全面见解。

论文解读：肠道真菌组及其跨界相互作用与断奶后母猪发情回归的关联研究

一、研究背景与意义

在养猪生产中，断奶至发情间隔（weaning-to-estrus interval, WEI）是衡量繁殖效率的关键指标。尽管遗传选育和管理优化已将平均WEI从20世纪80年代的11.5至20.5天缩短至目前的5至7天，但仍有约15%的母猪在断奶后7天内未能成功发情，导致非生产天数增加，显著降低每头母猪每年提供的断奶仔猪数，造成重大经济损失。断奶后发情主要受泌乳停止所触发的激素变化驱动，但营养、遗传和管理条件等多重因素均会影响该过程的时机和成功率。近年来，肠道微生物群在调控宿主生殖功能中的作用日益受到关注。研究人员前期研究发现，肠道细菌普雷沃氏菌属（Prevotella spp.）通过调节性类固醇激素代谢影响断奶后母猪发情回归。然而，肠道真菌组作为肠道微生物群落的重要组成部分，在该过程中的作用及其与细菌的跨界相互作用仍 largely unexplored。本研究旨在通过宏基因组测序技术系统表征断奶后母猪的肠道真菌组，鉴定与发情回归相关的关键真菌特征，分析真菌-细菌跨界相互作用，并评估多界标志物组合的判别能力，从而为肠道真菌组在母猪繁殖性能中的作用提供全面见解。

二、主要技术方法

研究人员从中国福建省两个独立商业化猪场采集了114头长白×大白母猪的粪便样本，其中85头作为发现队列，29头作为独立验证队列。所有母猪在断奶当天下午采集粪便样本，基于断奶后发情间隔将母猪分为正常组（断奶后7天内发情）和非发情组（断奶后14天内未发情）。粪便样本采用宏基因组测序技术进行微生物DNA分析，通过构建包含666个真菌基因组的定制参考数据库进行真菌物种分类和丰度估计，采用单样本分箱策略获得细菌宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, MAGs），构建基因组规模代谢模型（genome-scale metabolic models, GEMs）并结合SMETANA评估真菌-细菌代谢相互作用，利用线性判别分析效应大小（LEfSe）鉴定差异丰度物种，构建随机森林（Random Forest, RF）分类模型评价生物标志物判别性能，并通过Procrustes分析和Spearman相关分析整合粪便代谢组与功能通路数据。

三、研究结果

（一）断奶后母猪肠道真菌组组成概览

宏基因组测序共获得37,388,843条真菌序列读段，平均占微生物总读段的0.61%。稀释曲线分析表明测序深度足以捕获真菌多样性。在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）占比超过75%，为最优势门类，其次为担子菌门（Basidiomycota）。在属水平上，Wickerhamomyces和Arxiozyma为优势属。物种水平分析显示，Wickerhamomyces ciferrii为最丰富物种，Arxiozyma slooffiae相对丰度存在个体间差异。

（二）鉴定与断奶后发情回归相关的真菌物种

Alpha多样性分析显示正常组与非发情组间Shannon和Simpson指数无显著差异，但Beta多样性分析（Bray-Curtis距离）揭示两组间真菌群落组成存在显著变化（PERMANOVA，p < 0.05）。LEfSe分析共鉴定出22个在两组间存在显著差异的真菌物种（LDA score ≥ 2，FDR < 0.05），其中7个在正常组富集，包括Arxiozyma slooffiae、Meira miltonrushii、Fusarium solani等，15个在非发情组富集，包括Malassezia pachydermatis、Lodderomyces beijingensis及多个链格孢属（Alternaria）物种。多元逻辑回归分析在校正胎次后验证了这些关联。

（三）与发情回归相关的跨界真菌-细菌相互作用

Spearman相关分析发现真菌与细菌物种丰富度之间存在显著正相关（rho = 0.29，FDR < 0.05），提示两界微生物在断奶后母猪肠道中可能存在互利关系。相关网络分析显示，同一组内富集的真菌和细菌倾向于正相关，而不同组间富集的类群呈负相关。正常组富集的真菌如Arxiozyma slooffiae与普雷沃氏菌属等细菌形成正相关模块；非发情组富集的真菌则与Bacteroides fragilis等细菌形成另一正相关模块。SMETANA代谢模型分析预测Fe²⁺、硫胺素、L-赖氨酸、磷酸盐、硫化氢和烟酸盐为真菌-细菌间最常交换的代谢物。

（四）联合真菌和细菌生物标志物增强发情回归判别性能

基于真菌相对丰度构建的随机森林模型在发现队列中表现出良好的判别性能（AUC = 0.906，准确率 = 0.871），但在独立验证队列中性能中等（AUC = 0.631）。将48个差异细菌MAGs纳入模型后，发现队列的AUC提高至0.947，验证队列的AUC亦提升至0.657，表明多界标志物组合可增强判别能力。

（五）肠道真菌变化与发情回归相关代谢和功能改变

Procrustes分析显示肠道真菌群落与粪便激素和激素相关化合物（rho = 0.5069，FDR < 0.001）及微生物功能通路（rho = 0.6109，FDR < 0.001）之间存在显著一致性。Spearman相关分析表明，正常组富集的真菌，特别是Arxiozyma slooffiae，与植物雌激素（包括大豆黄酮和染料木素）、雌酮-3-硫酸盐及类固醇激素生物合成、卵巢类固醇生成和雌激素信号通路呈正相关；非发情组富集的真菌则与睾酮、肾上腺甾酮等雄激素及孕激素相关化合物呈正相关，并与类固醇降解通路正相关。

四、讨论与结论

本研究首次系统描绘了断奶后母猪肠道真菌组图谱，并建立了真菌群落组成与发情回归之间的关联。研究发现的真菌比例（0.61%）高于近期大规模猪肠道真菌调查的平均值，这主要归因于更深的测序深度。肠道真菌门水平组成与已有研究高度一致，子囊菌门和担子菌门为优势门类。Arxiozyma slooffiae作为健康的猪肠道核心共生真菌，在正常组富集可能通过促进肠道上皮糖酵解等机制支持发情回归。相反，非发情组富集的潜在致病真菌与肠道炎症和真菌失调相关。真菌-细菌跨界相互作用网络及代谢模型预测揭示了两界微生物间的复杂代谢交换关系。肠道真菌与生殖激素相关化合物和通路的广泛关联提示真菌组可能与断奶后母猪的生殖激素稳态相关。研究存在一些局限性，包括相关性研究设计无法确立因果关系、验证队列样本量有限、极端表型设计排除了中间表型母猪，以及部分肠道真菌缺乏高质量参考基因组可能导致多样性低估。尽管如此，本研究为肠道真菌组及其跨界相互作用在母猪断奶后繁殖性能中的重要作用提供了有价值的证据，为未来功能研究和机制阐明奠定了基础。

结论部分：总而言之，本研究提供了断奶后母猪的首个全面肠道真菌组图谱，并揭示了其与发情回归的显著关联。研究人员鉴定出两组间差异丰度的真菌物种，并证明了与发情回归相关的真菌和细菌跨界相互作用。多组学整合揭示了肠道真菌与生殖激素相关化合物和功能通路之间的广泛关联。尽管因果关系和潜在机制仍需进一步确认，本研究提供了有价值的证据，表明肠道真菌群可能是与母猪断奶后繁殖性能相关的肠道微生物组的重要组成部分。