广金钱草MYB转录因子家族的全基因组鉴定与表达分析

《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide identification and expression analysis of the MYB transcription factor family in Desmodium styracifolium

　　

摘要

引言：广金钱草（Desmodium styracifolium）的地上部分在传统中医中被广泛用于治疗尿路结石，其中黄酮类化合物是主要活性成分。MYB转录因子是植物黄酮类化合物生物合成的关键调控因子；然而，广金钱草中MYB家族尚未被系统研究。

方法：利用先前获得的全基因组和转录组数据，通过联合hmmsearch和blastp筛选鉴定DsMYB基因。与131个拟南芥（Arabidopsis thaliana）MYB蛋白一起重建系统发育关系。分析了染色体定位、共线性、保守基序、基因结构和启动子顺式作用元件。分析了不同组织及高光处理下的表达模式，并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证了8个代表性基因。

结果：共鉴定出161个DsMYB基因，划分为R2R3-MYB（134个）、1R-MYB（21个）、3R-MYB（5个）和5R-MYB（1个）亚家族；其中132个基因不均匀分布于9条染色体上，其余29个位于未定位的支架上。共线性分析表明，片段重复是R2R3-MYB扩展的主要驱动力。系统发育分析将其分为25个亚组，其中最大的亚组C13（30个成员）为广金钱草特有，亚组C20和C17分别对应拟南芥的花青素和黄酮醇调控分支。大多数DsMYB蛋白共享核心保守基序2~5，其启动子富含光、脱落酸和茉莉酸甲酯响应元件。经qRT-PCR验证的8个DsMYB基因表现出组织特异性表达和高光处理下的差异性诱导模式。

讨论：本研究首次对广金钱草MYB家族进行了系统表征。光响应和激素响应顺式元件的富集，以及候选成员的光响应表达，暗示DsMYB参与黄酮类化合物生物合成的转录调控，其中C17和C20亚组是黄酮醇和花青素调控的优先候选。

论文解读：广金钱草MYB转录因子家族的全基因组鉴定与表达分析

一、研究背景与意义

广金钱草（Desmodium styracifolium (Osbeck) H.Ohashi & K.Ohashi）为豆科植物，俗称广东金钱草，在传统中医（TCM）中具有重要地位。其干燥地上部分常用于尿路结石的临床治疗，是该病症治疗的主要原料药材，具有显著的药用和经济价值。化学分析表明，广金钱草含有黄酮类、生物碱、鞣质和多糖等多种化合物，其中黄酮类化合物被确定为其治疗尿路结石的主要活性成分。值得注意的是，从该药材中纯化的总黄酮已开发为国家1.2类新药，自2022年起在中国上市。此外，夏佛塔苷作为该物种中含量最丰富的黄酮类化合物，已被《中国药典》指定为官方质量评价标志物。

黄酮类化合物的生物合成受多种转录因子调控，其中MYB（成髓细胞瘤）家族发挥核心作用。MYB转录因子广泛存在于植物中，参与多种生物学过程，其典型特征是具有高度保守的DNA结合域，通常由约52个氨基酸残基组成，含有一至四个不完全重复单元。根据重复单元数量，MYB因子分为四大类：1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB。现有研究已确认MYB因子在黄酮类代谢途径中的关键作用。然而，广金钱草中黄酮类化合物生物合成的分子调控机制仍知之甚少，特别是MYB家族尚未被系统鉴定或功能分析。因此，本研究旨在利用全基因组数据系统鉴定所有MYB家族成员，通过综合生物信息学分析表征这些基因，并通过顺式作用元件和表达谱分析预测其潜在功能，筛选参与黄酮类化合物生物合成调控的核心候选基因。

二、主要技术方法

研究人员利用前期基于第三代测序技术获得的广金钱草全基因组序列和基因注释数据。采用hmmsearch（基于Pfam数据库MYB保守结构域文件PF00249，E值≤1e-10）和blastp（以拟南芥TAIR10的MYB蛋白序列为参考查询，E值≤1e-5，一致性≥50%）双重筛选策略系统鉴定DsMYB基因，并通过NCBI Batch CDD-search进行结构验证。使用MAFFT进行多序列比对，FastTree构建系统发育树，EvolView平台进行可视化。利用TBtools进行染色体定位和共线性分析（MCScan），PlantCARE预测启动子顺式作用元件。表达分析方面，提取根、茎、叶组织的总RNA，对8个高表达基因进行qRT-PCR验证（EF-1α为内参基因，2?ΔΔCt法计算表达量），并进行了72小时连续高光处理下的表达响应分析。样本采集自广州中医药大学“时珍山”药用植物园。

三、研究结果

**3.1 基因鉴定与理化性质分析**

通过hmmsearch和blastp联合基因挖掘策略及人工筛选，在广金钱草基因组中共鉴定出161个含MYB或MYB样重复序列的蛋白序列，命名为DsMYB001至DsMYB161。根据结构域重复次数，这些MYB成员分为四类：R2R3-MYB（134个）、1R-MYB（21个）、3R-MYB（5个）和5R-MYB（1个）。DsMYB蛋白长度为88至1654个氨基酸，分子量范围为10.27至179.91 kDa。89个成员的等电点呈酸性（pI<7.0），72个呈碱性（pI>7.0）。大多数DsMYB蛋白为不稳定蛋白。所有DsMYB蛋白均为亲水性，脂肪族氨基酸指数提示较高的热稳定性。亚细胞定位预测显示93%定位于细胞核。

**3.2 系统发育分析**

利用161个DsMYB蛋白和131个已表征的AtMYB成员构建系统发育树，结果显示DsMYB蛋白聚为25个不同亚组，其中广金钱草和拟南芥共同出现在23个亚支中。最大的亚组C13为广金钱草特有，包含30个成员，表明这些基因可能在该物种内经历了独立进化。而S12、S10和S16亚组仅包含AtMYB基因，表明广金钱草进化过程中可能丢失了这些直系同源基因。根据前人研究，拟南芥S6亚组成员调控花青素生物合成，S7亚组成员调控黄酮醇生物合成，因此本研究中的C20（S6）和C17（S7）亚组可能与此类代谢途径相关。

**3.3 染色体定位与共线性分析**

染色体定位分析显示，161个DsMYB基因中有132个不均匀分布在9条染色体上，其余29个位于未定位支架上。1号染色体包含最多DsMYB基因（51个），其次为2号和3号染色体（各18个）。共线性分析表明DsMYB基因在广金钱草不同染色体间表现出高度共线性，132个DsMYB基因通过全基因组重复形成103对共线性基因对，提示全基因组重复是该家族扩展的主要驱动力。种间共线性分析显示84个DsMYB成员与AtMYB直系同源基因形成141个共线性基因对，表明两个物种的MYB家族可能起源于古老的重复事件。

**3.4 保守基序、结构域和基因结构分析**

对161个DsMYB成员进行保守元件分析，共预测10个基序。大多数DsMYB成员包含基序2、3、4和5，且这些基序在N端依次排列，表明它们在该家族内相对保守。所有DsMYB蛋白包含四个基本结构域：Myb_DNA、PLN03091、REB1和SANT。基因结构分析显示外显子数量为1至13个，内含子数量为0至12个。同一亚家族内的基因通常具有相似的结构组织，但特定亚家族内观察到外显子数量的显著差异，表明DsMYB基因在进化分化过程中可能发生了外显子获得和丢失事件。

**3.5 启动子顺式调控元件分析**

对起始密码子上游2000 bp序列进行分析，共鉴定出3106个顺式作用元件，其中TATA-box和CAAT-box分布最广。功能分类显示光响应元件占绝对优势（共2418个），其中Box-4（986个）和G-box（409个）的高频出现强烈表明DsMYB家族可能作为整合环境光信号、昼夜节律和胁迫响应的调控网络枢纽。此外，检测到大量脱落酸响应元件（ABRE，389个）和茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif、CGTCA-motif，342个），表明DsMYB基因参与激素介导的防御和生存。G-box和ABRE元件的共现进一步暗示DsMYB蛋白可能参与“光-胁迫交叉耐受”机制。还鉴定到低频率的厌氧诱导元件、低温响应元件、种子特异调控元件和昼夜节律控制元件。值得注意的是，参与黄酮类生物合成调控的MYB结合位点（MBSI）也存在。这些结果表明DsMYB基因启动子区富含与环境和发育信号相关的多样性元件。

**3.6 DsMYB基因家族表达模式**

转录组数据分析显示161个DsMYB基因至少在一个组织中表达，其中136个成员在所有组织中均有表达。FPKM值为0至148，茎中相对表达水平最高。多个DsMYB基因表现出组织特异性表达模式，如DsMYB125和DsMYB128在五个组织中均高表达，而DsMYB037、DsMYB042、DsMYB078和DsMYB079在花中特异性表达。通过qRT-PCR验证8个差异表达基因，与转录组数据一致，DsMYB016、DsMYB121、DsMYB125和DsMYB128主要在根中表达，DsMYB021和DsMYB062在花中高表达，DsMYB108在茎中显著高表达。高光处理72小时后，大多数DsMYB基因的表达被显著诱导，其中叶片中的诱导最为明显。

四、讨论与结论

本研究中鉴定到的161个DsMYB转录因子数量在被子植物MYB基因家族的典型范围内。染色体定位显示DsMYB基因在九条染色体上不均匀分布，片段重复是R2R3-MYB家族扩展的主要驱动力。C13亚组的物种特异性分化支持了MYB家族在进化过程中通过谱系特异性分化以适应不同生态位的观点。启动子顺式作用元件分析显示DsMYB调控区富含光和激素响应元件，其中G-box与ABRE元件的频繁共现强烈表明DsMYB家族是连接ABA依赖的胁迫响应通路与光和昼夜节律调控网络的重要分子桥梁。结合系统发育聚类、启动子顺式元件特征以及组织特异性和高光胁迫表达谱，研究人员提出C17亚组成员是调控广金钱草C-糖基黄酮生物合成的最有希望的候选基因。本研究系统阐明了DsMYB基因家族的基本特征，为该豆科药用植物未来的深入功能表征、分子育种和合成生物学应用提供了坚实的理论基础和重要的遗传靶点。