多组学分析揭示草果果实非挥发性萜类的形状和干燥依赖性变化

《Frontiers in Plant Science》：Multi-omics analysis reveals shape- and drying-dependent variation in non-volatile terpenoids of Amomum tsao-ko fruits

　　

草果（Amomum tsao-ko）是一种珍贵的药用和食用资源，但其非挥发性萜类化合物组成仍鲜有表征。本研究整合广泛靶向代谢组学与转录组学，系统分析了草果果实中的非挥发性萜类化合物，并探究了果实形态型及干燥过程的影响。利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）鉴定出157种非挥发性萜类化合物，其中147种在所有样品中共同存在，表明存在稳定的核心代谢组。果实形状显著影响萜类积累，圆形果实通常表现出更高水平，且Caesalpin J被确定为形状判别标记物。干燥诱导了深刻变化，促进糖基化形式的同时减少了游离倍半萜和二萜。Isosteviol仅在干燥果实中检测到，可作为干燥特异性标记。转录组分析揭示了49个富集于萜类生物合成途径的形状响应差异表达基因。加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出一个含有关键结构基因和转录因子的萜类相关模块。这些发现为草果的品质评价、种质创新及加工优化提供了基础化学与分子图谱。

草果（Amomum tsao-ko）是姜科多年生草本植物，特产于中国西南及东南亚邻近地区，其干燥成熟果实既是传统中药（具有温中散寒、燥湿消食等功效），也是特色烹饪香料，属于典型的“药食同源”资源。萜类化合物是草果主要的活性成分之一，但既往研究多聚焦于挥发性萜类（如精油中的单萜和倍半萜），对其非挥发性萜类（如二萜、三萜及其糖苷衍生物）的系统表征严重不足。同时，果实形态（长形、椭圆形、圆形）和采后干燥处理可能影响次生代谢物积累，但相关机制尚不明确。为填补这一空白，研究人员设计了一项整合广泛靶向代谢组学与转录组学的研究，旨在系统鉴定非挥发性萜类、解析形态与干燥引起的化学变异，并揭示其转录调控基础。

研究人员于2022年10月21日从云南省红河州金平苗族瑶族傣族自治县大寨乡新发寨村（22°88′78″N，103°33′E，海拔1775 m）采集了三种形态型（按长宽比分为长形>1.5、椭圆形1.5-1.1、圆形1.1-1.0）的草果成熟果实。每个形态型选取3株单株作为生物学重复，每株取20个果实去皮，其中10个鲜果立即液氮冷冻作为鲜样，另10个在80℃干燥48小时后去皮质备作为干样，共获得L1（长形鲜）、O1（椭圆形鲜）、R1（圆形鲜）、L2（长形干）、O2（椭圆形干）、R2（圆形干）6组样品，每组3个重复。研究采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）结合广泛靶向代谢组学方法，利用多反应监测（MRM）模式鉴定非挥发性萜类；对鲜果进行RNA-seq转录组测序；数据分析包括主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、DESeq2差异表达基因鉴定及加权基因共表达网络分析（WGCNA）等。

#### 3.1 非挥发性萜类的综合谱图及特征分析
通过UPLC-MS/MS共鉴定157种非挥发性萜类，包括34种单萜、61种倍半萜、3种萜烯、33种二萜和26种三萜。147种（93.63%）在所有样品中均存在，说明草果具有稳定的核心代谢组。PCA显示干燥是导致代谢谱分离的首要因素（PC1解释34.24%方差），鲜样与干样沿PC1完全分开；形态差异沿PC2体现，但鲜样形态间有显著分离，干样中圆形与长形、椭圆形差异仍显著。

#### 3.2 高丰度非挥发性萜类及其分布模式
在所有样品中，二萜Ajugalaevigatic acid和倍半萜Kobusone始终是丰度最高的两种成分。共有5种高丰度成分（Confertifoline、Kobusone、3,9-Dihydroxy-13(14)-labden-16,15-olide、Ajugalaevigatic acid、6β-Hydroxy-8α-methoxyeremophila-1(10),7(11)-dien-12,8β-olide）在所有样品中稳定积累；单萜7-O-(4''-O-glucosyl)coumaroyl-loganic acid是鲜果特有高丰度成分，二萜Cafestol和倍半萜5-hydroxyindene-1,3-dione则常见于干果。此外，Caesalpin J在圆形鲜果中高丰度，Dehydroabietic acid等具有形态特异性。

#### 3.3 非挥发性萜类差异代谢物综合分析
**3.3.1 不同形状鲜果间差异非挥发性萜类**
在3个鲜果比较组（L1 vs O1、L1 vs R1、O1 vs R1）中共鉴定42个差异代谢物（DNVTMs）。总体呈现圆形>长形>椭圆形的含量趋势。Caesalpin J是唯一在所有比较组中共有的差异代谢物，其含量顺序为O1>R1>L1，可作为区分鲜果形状的可靠标记。Germacrone在长形鲜果中未检出，而Curcumenol在椭圆形鲜果中缺失。

**3.3.2 不同形状干果间差异非挥发性萜类**
干果比较组中鉴定出51个DNVTMs，数量较鲜果显著增多。长形与椭圆形干果比较中，大部分差异代谢物在椭圆形中下调（如Germacrone、Curcumenol在O2中未检出）；长形与圆形干果比较中，17个代谢物在圆形中上调，尤其倍半萜9-Hydroxyselina-3,11-dien-12-al在R2中含量比L2高约13倍；椭圆形与圆形比较中，17个在R2中上调。三组共有的差异代谢物为三萜3-Hydroxytaraxastan-28,20-olide。结果表明干燥可能放大形状间的化学差异。

**3.3.3 草果鲜果与干果间差异非挥发性萜类分析**
同一形状鲜干比较分别鉴定出32（长形）、36（椭圆形）、46（圆形）个DNVTMs，圆形果实变化最剧烈。总体趋势是干燥导致游离倍半萜和二萜下调，如Spathulenol（log₂FC=-3.04～-3.31）、isoacolamone、Coronarin E、Zerumin B等；同时糖基化单萜和部分倍半萜内酯上调，如6-O-Glucosyl-leucolactone（log₂FC>4）、Atractylenolide III。Venn分析确定11个共有的干燥响应差异代谢物，其中4个（Atractylenolide III、Blumenol C malonyl Glucoside、6-O-Glucosyl-leucolactone、3'',5''-Dehydroxycornuside）在干果中一致上调，7个（如Spathulenol、isoacolamone、Coronarin E等）一致下调。Isosteviol仅在干果中检出，可作为干燥特异性标志物。

#### 3.4 形状依赖性萜类变异的转录组基础
对鲜果进行RNA-seq，检测到28645个表达基因。L1 vs O1、L1 vs R1、O1 vs R1比较组分别有3793、3848、4254个差异表达基因（DEGs），其中482个为三组共有的核心形状响应基因。GO富集显示这些基因显著富集于“萜类生物合成过程”和“萜类代谢过程”；KEGG富集于“代谢途径”和“次生代谢物生物合成”，表明转录调控是形状特异萜类谱的关键驱动因素。

#### 3.5 通过WGCNA鉴定萜类相关基因共表达模块
利用所有鲜果转录组数据进行WGCNA，选择软阈值18构建网络，共获得6个共表达模块。模块-性状相关性分析显示黄色模块与11个关键萜类（包括单萜Kankanoside E/K、倍半萜Spathulenol、Nootkatone等）显著正相关，与三萜30-Norhederagenin负相关。KEGG富集显示该模块显著富集于萜类骨架生物合成和二萜生物合成途径。因此黄色模块是调控萜类积累的核心网络。

#### 3.6 萜类相关模块中的关键基因及调控网络
黄色模块包含多个编码萜类生物合成酶的基因，覆盖MVA和MEP途径：6个骨架基因（如DXS、FPPS、GGPPS、HMGR等），5个二萜合成基因（如GA20ox、KAO、LDS等），8个倍半萜合酶基因（如TPS21、PO等），1个单萜合酶基因TPS8。表达相关性分析表明这些结构基因与对应萜类含量显著相关。模块内还鉴定出27个转录因子（TF），分属AP2/ERF、bHLH、MYB、NAC等家族，其中AP2/ERF-4、AP2/ERF-5、MADS等与多个结构基因共表达，提示它们是潜在的调控枢纽，可能协调形状依赖性的萜类合成。

讨论部分总结了本研究的意义：首次全面描绘草果非挥发性萜类图谱，发现其核心代谢组高度保守；果实形态与化学型显著关联，圆形果实通常具有更高萜类含量，Caesalpin J可作为形态标记；干燥过程通过促进糖基化、降解或挥发游离态萜类重塑化学组成，Isosteviol的干燥特异性出现表明干燥可生成新化合物。转录组和WGCNA共同揭示了形状差异的分子机制，并提出了候选结构基因和转录因子。研究局限性包括缺乏qRT-PCR验证、采样点单一等，未来需进行基因功能验证和药理学评价。

最终，研究结论可翻译如下：本研究首次对草果（Amomum tsao-ko）的非挥发性萜类进行了全面表征，揭示了丰富且保守的代谢组，其变异显著受果实形态型和采后干燥影响。共鉴定157种萜类，其中5种核心高丰度化合物构成稳定的化学特征。果实形状（尤其是圆形）与较高的萜类含量和独特的代谢谱相关，鲜果和干果均如此。干燥过程持续促进糖基化萜类积累，同时减少游离形式，其中圆形果实的代谢重编程最为显著。转录组分析发现了一组富集于萜类生物合成的形状响应基因，WGCNA鉴定出一个与萜类积累紧密相关的共表达模块，突出了关键结构基因和潜在调控转录因子。这些综合发现为草果的品质分级、种质选择和加工优化提供了有价值的见解，支持其作为药食两用资源的可持续发展。未来研究应聚焦候选基因的功能验证及关键萜类的药理学评价，以进一步阐明其生物活性和商业潜力。