《Frontiers in Microbiology》：Proteolytic Clostridium botulinum (group I) – evaluation of predictive models for time-to-toxicity and identification of product characteristics that prevent growth and toxin formation in different types of foods
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摘要
防止蛋白水解性肉毒梭菌（proteolytic Clostridium botulinum）形成毒素对食品安全至关重要，但在开发或重新配方多种产品（包括低钠或无亚硝酸盐食品）时仍是一大挑战。经验证的预测性食品微生物学模型可通过识别可防止生长和毒素形成的
摘要
防止蛋白水解性肉毒梭菌（proteolytic Clostridium botulinum）形成毒素对食品安全至关重要，但在开发或重新配方多种产品（包括低钠或无亚硝酸盐食品）时仍是一大挑战。经验证的预测性食品微生物学模型可通过识别可防止生长和毒素形成的产品特性与储存条件的组合来支持这一过程。研究人员将一个现有的基数参数生长与生长边界模型（Koukou et al., 2022b）（包含11种环境因素及其交互作用的影响）扩展，以预测蛋白水解性肉毒梭菌的产毒时间（time-to-toxicity, TTT）。研究人员汇编了来自962项已发表TTT实验的数据，以评估该模型不同版本的表现。研究人员收集了肉类、禽肉、蔬菜、海产品、面团、再制干酪、其他干酪及未分类食品的产品特性、储存条件和TTT。这些数据包括648个TTT阳性和314个TTT阴性结果，覆盖了广泛的环境因素，并包含了138株蛋白水解性肉毒梭菌菌株的响应。模型性能通过失败-危险（fail-dangerous）、失败-安全（fail-safe）和正确预测的百分比以及预测与观测TTT的偏差因子（bias factor）和准确因子（accuracy factor）进行评估。模型性能在非乳制品和乳制品之间存在显著差异。对于非乳制品，在广泛的应用范围内（包括494个TTT响应），新的扩展Koukou-TTT模型具有0.2%的失败-危险TTT预测，偏差/准确因子为0.53/2.5。对于乳制品（n=312），包括再制干酪和其他干酪，Koukou-TTT模型提供了26.0%的失败-危险TTT预测。这种不可接受的模型性能主要是由于钙与柠檬酸和乳酸的络合作用降低了这些有机酸在所研究乳制品中的抑制作用。研究人员对Koukou-TTT模型进行了修改，以预测乳制品中柠檬酸和乳酸的总浓度（而非未解离浓度）的影响。该修改模型预测了144个TTT响应，失败-危险TTT预测为0.0%，偏差/准确因子为0.37/4.42。原始和修改后的生长与生长边界Koukou模型可在明确且广泛的应用范围内使用，以确定可防止肉类、禽肉、蔬菜、海产品、面团和乳制品中蛋白水解性肉毒梭菌生长和TTT的产品特性与储存条件组合。
蛋白水解性肉毒梭菌（I群）产毒时间预测模型评估与防生长产毒产品特性识别研究解读
**研究背景与目的**
蛋白水解性肉毒梭菌（proteolytic Clostridium botulinum，Group I）是一类重要的产芽孢食源性致病菌，能够在10–12°C以上的食品中生长，并产生剧毒的肉毒神经毒素（botulinum neurotoxins，BoNTs），主要型别为A、B和F型。食源性肉毒中毒是一种严重的神经麻痹性疾病，恢复期长，致死率达5–10%。该类菌的芽孢广泛存在于土壤中，对热及其他加工处理具有较强抵抗力，可污染多种食品原料和产品。目前控制其生长和产毒的主要手段包括：食品储存温度低于10°C、pH低于4.6、水相盐（water phase salt，WPS）高于10%，或经相当于121°C、3分钟的热处理。然而，这些单一控制措施对许多食品而言会带来成本、感官和技术特性方面的负面影响。因此，采用多种保藏因子组合以有效抑制生长和毒素形成，同时尽量减少对感官和技术特性的不利影响，具有重要实际意义。通过实验方法筛选这些组合往往费力且昂贵，而经充分验证的预测性食品微生物学模型可以成为有效的辅助工具。然而，针对蛋白水解性肉毒梭菌的生长预测模型验证研究非常有限，而产毒时间（time-to-toxicity，TTT）数据相对丰富。已有模型未能在多种相关食品类型中得到充分评估和验证。本研究旨在利用已发表的TTT数据，评估此前开发的Koukou等人（2022b）生长与生长边界模型的预测性能，确定其可有效预测生长和毒素形成是否被阻止的条件范围，并据此为不同食品的配方设计提供支持。
**主要技术方法**
研究人员从科学文献中系统收集了962个TTT挑战试验响应数据，涵盖肉制品、禽肉制品、海产品、面团制品、蔬菜、未分类食品以及再制干酪和其他干酪，同时记录产品特性（温度、pH、WPS/水分活度aw、干物质、脂质、有机酸、磷酸盐、亚硝酸盐、钙含量等）和储存条件。研究采用基数参数模型结构，将生长模型扩展为TTT预测模型，利用15组同时报道生长和产毒的动力学术数据确定与产毒对应的细胞浓度增量（ΔNTTT）。模型性能通过失败-危险（fail-dangerous）、失败-安全（fail-safe）和正确预测百分比以及偏差因子（bias factor，Bf）和准确因子（accuracy factor，Af）进行评价。针对乳制品中钙与柠檬酸、乳酸的络合作用，构建了基于平衡常数和物料平衡方程的计算方法，并对模型进行修正，以总酸浓度替代未解离酸浓度。样本数据来源于已发表的同行评议文献，未包含液体培养基数据、无法估计关键保藏因子的数据及概率性产毒数据。
**研究结果**
**3.1 TTT数据与产品特性的收集**
研究人员从46项挑战试验研究中提取了包含962个TTT响应的综合数据集，涉及138株不同编号的蛋白水解性肉毒梭菌分离株，其中648个响应观察到产毒，314个未检测到产毒。储存时间从1至392天不等，观测TTT范围为0.5至336天。产品特性覆盖温度4–35°C、pH 4.4–8.5、WPS 0.0–9.5%、实测aw 0.920–0.994、多种有机酸和磷酸盐浓度范围等。所有数据均来自储存温度和产品特性保持恒定的挑战试验。
**3.2 生长模型扩展为TTT预测**
通过15组同时报道生长和产毒的动力学术数据，确定与产毒对应的细胞浓度增量为129 CFU/g，log(ΔNTTT)为2.11±0.79。将这一数值与Koukou等人（2022b）模型预测的滞后时间和最大比生长速率结合，构建了新的TTT预测模型。该模型可预测广泛环境因素下的TTT，但初始芽孢浓度高于4.7 log CFU/g时无法进行定量TTT预测，此时仅依据μmax是否大于0进行定性判断。
**3.3 Koukou模型扩展预测TTT的评估**
**3.3.1 食品基质和初始芽孢浓度对TTT模型性能的影响**
当使用完整TTT数据集评估时，新模型对非乳制品的预测性能明显优于乳制品。乳制品的失败-危险TTT预测百分比为26.0%，远高于非乳制品的5.8%；准确因子Af-TTT值乳制品为4.37，非乳制品为2.55。非乳制品中模型性能指标与初始芽孢浓度无明显相关性，而乳制品中高初始芽孢浓度下失败-危险预测比例有所降低。使用估算aw或实测aw作为模型输入对失败-危险预测百分比影响不大。
**3.3.2 非乳制品模型性能评估**
非乳制品数据来自131株蛋白水解性肉毒梭菌菌株。在全数据范围（n=650）内，模型提供38个（5.8%）失败-危险TTT预测，且部分预测的ψ值远离生长边界。亚硝酸钠的添加分别使肉制品和禽肉制品的TTT平均延长3.1倍和1.8倍。脂质含量显著降低山梨酸（sorbic acid，SAC）的抑制效果。通过优化模型的适用范围（range of applicability，RoA），即降低pH上限、减少乙酸、苯甲酸、柠檬酸、乳酸和山梨酸的水相浓度范围，模型在494个TTT响应中仅提供1个（0.2%）失败-危险预测，81.4%正确和18.4%失败-安全定性预测，Bf-TTT/Af-TTT为0.50/2.54。
**3.3.3 乳制品模型性能评估**
**3.3.3.1 TTT模型的评估**
对乳制品（n=312）使用未修正模型时，失败-危险TTT预测高达26.0%，其中再制干酪为29.7%、其他干酪为8.9%。81个失败-危险预测中55个直接归因于未解离柠檬酸或乳酸浓度高于其最低抑制浓度（MIC）。模型明显高估了柠檬酸和乳酸在乳制品中的生长抑制作用。
**3.3.3.2 钙对乳制品TTT预测的影响**
乳制品中的钙使计算的游离柠檬酸和乳酸浓度分别降低90.1±10.1%和39.6±11.5%。考虑钙络合效应后，失败-危险预测从26.0%降至10.9%。进一步优化RoA（pH范围缩至5.20–6.90，柠檬酸水相浓度≤5,660 mg/L，乳酸水相浓度≤11,443 mg/L）后，模型在144个TTT响应中仅提供1个（0.7%）失败-危险预测，但失败-安全预测为24.3%，Bf-TTT/Af-TTT为0.37/4.6。
**3.3.3.3 修改型TTT模型的评估**
去除交互作用项的修改模型在全数据范围内提供17.9%失败-危险预测；在优化RoA内为1.4%。而采用总柠檬酸和乳酸浓度替代未解离浓度的修改模型，在优化RoA内提供0.0%失败-危险和23.6%失败-安全预测，Bf-TTT/Af-TTT为0.37/4.4。研究人员选择总酸浓度模型用于乳制品预测，因为其结构更简单且性能相当。
**3.4 最佳模型在其适用范围内的应用**
研究确定了两个独立的RoA：原始增长边界模型用于非乳制品，修改模型（总柠檬酸和乳酸浓度）用于乳制品。两种模型均可在各自RoA内用于预测可防止蛋白水解性肉毒梭菌生长和产毒的条件组合。模型应用建议ψ值≥2.0以确保安全性。预测情景示例表明，在pH 5.6、2.5% WPS条件下，特定浓度的乙酸、柠檬酸和乳酸组合可有效抑制生长，且山梨酸可在高脂产品中替代其他有机酸。对于再制干酪，在25°C、pH 5.60、1.80% WPS及特定有机酸和磷酸盐组合下可实现无生长预测。修改后的模型已纳入Food Spoilage and Safety Predictor（FSSP）软件，但不包含滞后时间和TTT预测功能，以避免误用。
**总结与展望**
本研究利用962个TTT响应评估了Koukou等人（2022b）模型对蛋白水解性肉毒梭菌在不同食品中的预测性能。原始增长和生长边界模型可在其RoA内、ψ值≥2的条件下，用于确定所研究的非乳制品中可防止生长和毒素形成的产品特性与储存温度组合。对于乳制品，模型需进行修改，或者考虑钙与柠檬酸和乳酸的络合作用，或者采用总柠檬酸和总乳酸浓度项。研究确定了模型在产品类型和环境因素范围方面的RoA。为便于正确应用最佳性能模型，非乳制品和乳制品版本均已纳入FSSP软件。在开发经充分验证、可准确预测不同食品TTT的模型之前，仍需进一步研究，包括对特性明确产品的系统研究。
